1865年5月28日,馬雅各正式為基督長老教會傳教士與醫生雙重身分,搭乘 Meta 號在臺灣打狗登陸,同行的人有杜嘉德牧師、吳水文、陳子路、黃嘉智、廈門會友李西霖、王阿炎。2-3天後,馬雅各進入府城(臺南),在北勢街(台南市神農街)天利行奈.麥斐兒(Mr. Neil Mcphail) 家作賓客[4]。
1865年6月16日,打狗海關 William Maxwell 頂讓他所租的台南府城看西街一屋給馬雅各,選擇作為布道所(今台南市中西區仁愛街43號),開始傳道醫病,傳道方式則是行醫為主,傳教為輔。1865年6月16日成為英國長老教會在台灣開始設教的日子,並為全台紀念日。7月9日,馬雅各遭到當地漢醫的排擠,並有說他取人心、眼睛來製藥的謠言出現,受到挑撥的民眾,包圍醫館,揚言拆除禮拜堂,並出手攻擊教會的人,終至引發大暴動,是為「看西街事件」,知縣請馬雅各在 3 日內撤離。馬雅各在府城落腳才短短23天,不得不轉移陣地。
1868年3月中旬,馬雅各經廈門及汕頭前往香港,在香港主教堂與Mary Anne Goodall小姐結婚,由宣維霖牧師(Rev. William Sutherland Swanson)主禮。 1870年4月1日,設立木柵禮拜堂,約120人參加禮拜。4月12日,馬雅各夫婦拜訪木柵2周。1871年1月8日,馬雅各主持開設可容納200人之柑仔林禮拜堂,當天約100人參加禮拜。1月15日,參加拔馬新禮拜堂獻堂。2月10日,徳馬太醫生(Dr. Matthew Dickson)來府城協助,他是英國長老教會駐臺第2位醫療宣教師[12]。