內標、外標定量與積分參數

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建立於 2026年10月22日

學習重點 掌握內標準法以「分析物與內標的訊號比值」定量，並理解它能校正注入量、檢測器反應及萃取等前處理變異的原因與條件。 熟記理想內標的選擇原則：結構與性質相似、安定、不與分析物反應、檢出器反應類似、濃度相近，以及滯留時間相近但不重疊；內標須依檢品重新選擇，不能一體通用。 熟練外標法的峰面積比例、稀釋倍率、體積回推及標示量百分比換算。 區分滯留資料用於定性、峰面積用於定量，並知道積分參數（如波峰閾值）設定不當主要影響峰面積的精密度與準確度。 核心觀念 一、層析定性與定量：先分清比較的對象 在相同層析條件下，比對分析物與對照標準品的滯留時間或滯留容積，可作為定性的依據。但不同物質可能具有相同或接近的滯留時間，故僅憑滯留時間一致，不能保證物質身分完全相同。 定量則利用分析物濃度與檢測器訊號的關係，通常以分析物濃度對峰面積作圖，經回歸建立檢量線。外標法使用分析物本身的峰面積；內標法使用分析物與內標的峰面積比。比較標準品與檢品時，須維持一致的分析條件。 二、內標準法：用共同變動的比值校正誤差 內標準法是在標準溶液及檢品中，加入等量且已知濃度的內標準品，再以分析物峰面積／內標峰面積進行定量。當注入量略有變動，或檢測器反應有整體漂移時，兩者訊號會同步增減，面積比便能抵銷這類變異。因此「加入內標是為了消除注入量及檢測器的誤差」是正確敘述。 設分析物及內標的峰面積分別為 Ax、AIS，濃度分別為 Cx、CIS，可建立「Ax／AIS」對「Cx／CIS」的檢量線。若各溶液的內標濃度固定，也可用面積比對分析物濃度作圖。不可未經校正，就假設兩物質等濃度時必有相同峰面積。 內標法改善的是定量的精確度與再現性，並不會讓檢測器偵測到更低濃度，所以不能說加入內標可增加（改善）檢測極限。 三、內標法最適用的情況：前處理複雜的檢品 軟膏（ointment）、乳膏（cream）及含油性賦形劑的檢品，須經有機溶劑分配萃取等多重步驟，常無法完全萃取，且每次回收率不一。此時內標法最為恰當：內標若與分析物具相近的萃取行為，兩者損失比例相同，面積比不受影響，可補償不完全萃取、提高定量精確度。 關鍵是在欲校正的處理步驟之前加入內標；若萃取完成才加入，便無法補償先前已發生的萃取損失。 定量方法原理適用與限制 外標法（external standard）另配已知濃度標準品，比較峰面積操作簡便；無法補償注入量變異與萃取損失，適合前處理簡單者 內標法（internal standard）檢品與標準品皆加入內標，以面積比定量可校正注入量、檢測器變異及前處理損失；最適合萃取複雜的軟膏、乳膏、油性製劑 面積歸一化法（normalized peak area）以某峰面積占所有峰總面積的百分比表示須所有成分皆被溶出、檢出且反應相近；多用於純度或組成比例，不能補償萃取損失 標準添加法（standard addition）在檢品中加入不同量的分析物標準品，外插求含量主要處理基質對訊號的影響；每個檢品需多次測定，不是補償萃取損失的首選 其他選項如衍生化（改變檢出性或揮發性）、改變溶媒系統、提高檢品濃度，都不能直接補償萃取不完全所造成的誤差。 四、理想內標準品的選擇 選擇原則作答判斷重點 結構與理化性質相似使萃取、前處理與層析行為相近；不是「結構完全不相關為佳」，也不要求分子量一定較小。 滯留時間相近，但充分分離在層析圖上不可與分析物或檢品其他成分重疊；不是「滯留時間應與分析物儘量遠離」。 在分析條件下安定前處理、儲存及分析過程中不易分解。 不與分析物反應避免改變分析物含量或生成干擾物；「能與待測成分發生化學反應」是錯誤敘述。 對檢出器有類似反應使用 UV／可見光檢測時，內標必須有適當吸收；「不具紫外光或可見光吸收」是錯誤敘述。 濃度與分析物相近使兩者訊號大小相當，均位於適當的線性範圍。 檢品原本不含且不受基質干擾，才能確知加入量。 內標必須隨分析物、檢品基質及方法條件重新評估，不同檢品可能含有與內標重疊的成分，或萃取行為不同，因此「內標一旦確定，可一體適用於不同檢品分析」是錯誤的。 實例：乳酸 CH3CH(OH)COOH 的內標選擇。乳酸為三碳的羧酸，選擇時應優先考量相同官能基與相近碳數： 丙酸 C2H5COOH：三碳、具羧酸基，結構與酸性最接近，為最適當內標。 丁酸 C3H7COOH：雖也是羧酸，但多一個碳，極性與滯留行為差異較大，次於丙酸。 丙醛、甲基乙二醛：為醛類（後者為酮醛），官能基不同，萃取與層析行為差異大，且醛基反應性較高。 五、GC 分析實例：萃取酸鹼控制與溫度梯度 以 GC 分析 bupivacaine 製劑中的不純物 dimethylaniline 時： 萃取：dimethylaniline 為鹼性芳香胺。若先將樣品酸化，胺會質子化成帶電的鹽類而留在水相，進入非極性 cyclohexane 的量反而減少，回收率下降。要提高萃取率應使其保持游離鹼（非離子）形式，即鹼化後再萃取。故「先酸化可增加回收率」為錯誤敘述。 滯留時間：dimethylaniline 分子較小、揮發性較高，滯留時間比 bupivacaine 短。 溫度梯度（程式升溫）：可依成分揮發性差異調整，兼顧解析度與分析效率。 定量：可使用內標準品法。 六、外標法與稀釋換算 外標法另外配製已知濃度的分析物標準溶液，以檢品與標準品的訊號比較定量。當反應在線性範圍內、截距可忽略，且進樣條件相同時： 檢品溶液濃度＝標準溶液濃度 × 檢品峰面積／標準品峰面積 計算步驟： 先由檢量線或面積比例求得實際進樣溶液濃度。 乘上稀釋倍率，還原原檢品溶液濃度。 乘上該溶液所代表的體積，求得分析物總量；濃度與體積單位須一致（mg／100 mL 乘以 mL 時記得除以 100）。 以實測含量除以標示含量，再乘以 100%，得標示量百分比。 例一（稀釋回推）：錠劑重 150 mg、標示含主成分 120 mg。檢品溶液經 40 倍稀釋，最終體積 250 mL，測得濃度 1.2 mg／100 mL：總量＝1.2 mg／100 mL × 40 × 250 mL＝120 mg；120／120 × 100%＝100%。錠重 150 mg 是干擾數字，不能當作分母（120／150＝80% 是另一種重量百分率，並非題目所問）。 例二（面積比例）：標示含 30 mg 的糖漿萃取後溶於 100 mL，峰面積 1100；標準品 30.00 mg／100 mL 峰面積 1000：檢品濃度＝30.00 × 1100／1000＝33.0 mg／100 mL，即 100 mL 中含 33.0 mg；33.0／30 × 100%＝110%。當檢品定容體積與標準品相同，且標準品濃度恰等於標示濃度時，標示量百分比＝面積比 × 100%，可快速求解。 七、積分參數：影響軟體如何計算波峰 層析軟體透過波峰閾值（peak threshold）、斜率靈敏度（slope sensitivity）及峰寬（peak width）等參數，辨識波峰、判定起訖點並積分面積。這些參數只改變資料處理，不會改變管柱實際的滯留或分離行為。 波峰閾值：設定過高可能忽略小峰或峰的拖尾部分；過低則可能把雜訊誤判為波峰。 斜率靈敏度：決定訊號斜率變化多大時判定為峰起點或終點；過敏或過鈍都會使起訖點偏移。 峰寬：應配合實際峰形；設定不當可能造成漏峰、錯誤分峰或合峰。 起訖點判定不一致，會使重複分析的峰面積起伏不定，首先損及峰面積的精密度；若持續漏算或多算，也會影響準確度。相對地，解析度、容量因子主要由滯留時間決定，峰效率（理論板數）也取決於滯留時間與峰寬，受閾值影響較小。 常考陷阱 「內標一旦確定，可一體適用於不同檢品」：錯。內標須依分析物、基質及方法條件個別選擇與確認。 「內標滯留時間應與分析物儘量遠離」：錯。應相近但不重疊；「相近」不等於「重疊」。 「內標理想上與分析物結構完全不相關為佳」：錯。應結構相似，萃取與層析行為才會相近。 「內標不具紫外光或可見光吸收」：錯。內標必須能被檢出器偵測，且反應宜與分析物類似。 「內標比待測成分分子量小」「能與待測成分反應」：錯。分子量大小不是要件；內標不可與分析物反應。 「加入內標可增加（改善）檢測極限」：錯。內標改善的是定量精確度，不是偵測靈敏度。 「萃取複雜的軟膏、乳膏宜用外標法、面積歸一化或標準添加法」：補償萃取損失與注入量變異，首選內標法。 「萃取鹼性胺類前先酸化可提高有機相回收率」：錯。酸化使胺離子化留在水相，應鹼化才易萃入有機溶劑。 「含量百分比除以錠劑總重」：題目問「實際含量相對標示量」時，分母是標示含量，不是錠重。 「稀釋倍率或 mg／100 mL 單位忘記換算」：務必乘回稀釋倍率，並注意 100 mL 與實際體積的換算。 「閾值設定不當主要影響解析度、容量因子或峰效率」：錯。閾值影響的是峰面積積分，尤其是精密度。 記憶口訣 內標五要：似、穩、近、分、不反應；先加才補前處理。結構相似、安定、滯留相近、充分分離、不與分析物反應；要補償萃取損失，必須在萃取前加入。 軟膏乳膏油性料，萃取麻煩找內標。 胺類萃有機，鹼化才游離。 外標：面積求濃度，稀釋要還原，乘體積得總量，除標示算百分。 閾值設不好，面積先受擾。