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學習重點 UV－Vis 是液相層析藥物分析最常用的偵測器，但它不是通用型偵測器。分析物必須在選定波長有足夠吸收，才會產生訊號。 螢光偵測器兼具高選擇性與高靈敏度。適用於本身具有螢光，或經衍生化後可產生螢光的分析物。光源通常為氙燈，靈敏度可達 ng 等級。 要熟記兩個代表性應用：維生素 B₂ 具有天然螢光；digoxin 劑量很小，經脫水、氧化處理後可用螢光偵測。 要能比較 RI、ELSD 與電化學偵測器的適用對象，重點有三項：RI 不適合梯度沖提、ELSD 可分析醣類、ECD 選擇性與靈敏度高，常用於生物檢品分析。 核心觀念 一、選擇偵測器前，先看分析物的性質 HPLC 把各成分分離後，要由偵測器將分析物的性質轉換成可測量的訊號。選用偵測器時，先確認分析物有沒有紫外吸收、會不會發螢光、是否容易發生氧化還原，再考慮濃度、樣品基質與沖提條件。 選擇性、靈敏度與通用性是三個不同的概念。 選擇性高：只對特定性質的物質有反應，能減少其他成分的干擾。 靈敏度高：濃度小幅變化就能產生明顯的訊號變化，有利於微量分析。 通用性：能偵測的分析物範圍很廣，幾乎不需要分析物具備特殊結構。 不能因為某偵測器最常用、靈敏度佳或線性範圍廣，就認定它是通用型。 二、紫外光－可見光偵測器：最常用，但有吸收才有訊號 UV－Vis 偵測器測量分析物吸收特定波長光線後，透射光強度的變化。在適當濃度範圍及測量條件下，吸光度與濃度符合 Beer－Lambert 定律，因此可用於定量。 許多藥物含有芳香環、共軛系統等發色團，所以 UV－Vis 的適用範圍很廣。再加上操作方便、靈敏度佳、線性範圍廣，它成為液相層析藥物分析最常用的偵測器。不過，缺乏適當發色團或在設定波長吸收太弱的物質，就不容易直接偵測，所以 UV 仍屬選擇性偵測器，不是通用型。 光二極體陣列偵測器（DAD，亦稱 PDA）也是吸收式偵測器。它能同時取得多個波長的吸收資訊，可用來比對光譜及評估峰純度。但它不是螢光偵測器，也不會讓原本吸收不足的分析物變得容易偵測。在選擇性與微量偵測方面，DAD 和 UV 屬於同一類，通常不如螢光偵測器。 UV 可以配合梯度沖提，但移動相在偵測波長的吸收必須夠低。如果溶劑組成改變造成背景吸收變化，仍可能引起基線漂移。 三、螢光偵測器：以激發與放射雙重條件提高選擇性 分析物吸收激發光後，會把部分能量以螢光形式放出。一般情況下，放射波長比激發波長長。偵測器會分別設定激發波長與放射波長，所以分析物必須同時符合兩個條件：能吸收激發光，而且能放出可測得的螢光，才會形成訊號。 由於多數物質不會發螢光，背景干擾很低，螢光偵測器因此具有高選擇性與高靈敏度，通常比 UV 靈敏許多。在 UV、RI、螢光、ELSD 的比較題中，若問「哪一種對分析物最具選擇性」，答案通常是螢光偵測器。 螢光偵測器的激發光源通常為氙燈，靈敏度可達 ng 等級。實際偵測極限仍會因分析物的螢光效率、儀器與分析條件而不同。 天然螢光：維生素 B₂（riboflavin，核黃素）本身具有強螢光。在飲料等成分複雜的基質中定量 B₂ 時，使用螢光偵測器可避開其他具紫外吸收成分的干擾，選擇性最好。 衍生化後產生螢光：螢光不足的分析物，可經化學處理轉變成螢光產物。Digoxin 劑量很小（約 100 µg／錠），直接用 UV 偵測的靈敏度不足；經脫水與氧化處理後會生成螢光產物，最適合用螢光偵測器測定。 螢光偵測通常可配合梯度沖提，但移動相組成、pH 與淬熄作用都會影響螢光強度，方法條件須適當控制。 四、其他 HPLC 偵測器 偵測器原理與適用對象選擇性、靈敏度與沖提限制 折射率偵測器（RI）測量流出液與參考移動相之間的折射率差。可分析缺乏紫外吸收的醣類等物質。近似通用型，但靈敏度較低。對溫度及移動相組成相當敏感，不適合梯度沖提。 蒸發光散射偵測器（ELSD）將流出液霧化、蒸發掉移動相，再測量殘留分析物粒子造成的散射光。可用於醣類、脂質等缺乏發色團的物質。適用範圍廣，但分析物必須比移動相不易揮發，移動相及添加劑也必須可揮發。可配合梯度沖提。 電化學偵測器（ECD）利用分析物在電極上發生氧化還原反應所產生的電流訊號。選擇性與靈敏度都非常高，普遍用於選擇性的生物檢品分析，例如兒茶酚胺類神經傳導物質。只對具電活性的物質有反應，移動相須能導電，且須控制 pH 與電位。 五、各偵測器重點總整理 偵測器通用／選擇性靈敏度梯度沖提關鍵字 UV－Vis／DAD選擇性（須具發色團）佳，線性範圍廣可最常用 螢光高選擇性很高（ng 等級）可氙燈、B₂、digoxin 衍生化 RI近似通用型低不適合對移動相組成、溫度敏感 ELSD廣用型（須非揮發性）中等可醣類、無發色團物質 電化學高選擇性很高通常不適合氧化還原、生物檢品 常考陷阱 「UV 線性範圍廣、靈敏度佳，屬於通用型檢測器」：這是錯誤敘述。前半句正確，錯在「通用型」。UV 只能偵測具發色團的物質，屬於選擇性偵測器。「UV 為高靈敏之通用型檢測器」的錯誤點也一樣。 「最常用」不等於「選擇性最高」：問最常用選 UV－Vis，問選擇性最高通常選螢光，兩者不要混淆。 以下敘述是正確的，不要誤判為錯誤： RI 對移動相組成敏感，不適合梯度沖提。 螢光偵測器通常使用氙燈激發，靈敏度可達 ng 等級。 ECD 選擇性與靈敏度都非常高，常用於選擇性生物檢品分析。 ELSD 可用於醣類分析。 「看到維生素就選 UV」：要辨認化合物特性。Riboflavin 具有天然螢光，題目問選擇性時要選螢光偵測器。 「Digoxin 劑量低，所以選 DAD」：DAD 本質上仍是吸收式偵測器。題目提到「脫水和氧化」，就是在提示衍生化成螢光產物，應選螢光偵測器。 「RI 適合梯度沖提」：錯誤。移動相比例改變本身就會改變折射率，造成嚴重的基線漂移。 「醣類無 UV 吸收，所以無法用 HPLC 分析」：錯誤。醣類可以用 RI 或 ELSD 偵測。 「螢光或電化學偵測器能測所有藥物」：錯誤。前者須具螢光或經衍生化，後者須具氧化還原活性。 記憶口訣 「常用看紫外，選擇想螢光；折光怕梯度，散射測醣類；電化看氧還。」 「螢光氙燈 ng 級；B₂ 自帶光，地高辛脫水氧化後發光。」