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學習重點 掌握電灑游離法（ESI）由帶電液滴、溶劑揮發與液滴分裂，形成氣相離子的過程，並與 APCI 的放電針機制區分。 區分正、負離子模式，以及質子化、去質子化與鈉、鉀離子加成；理解 ESI 屬於軟性游離，不以裂解碎片為特色。 了解多重帶電如何降低蛋白質的質荷比，並能由相鄰電荷態峰推算電荷數及分子量。 辨認抗體、多肽等大分子適用的游離源與質量分析器組合（ESI／TOF），以及適合直接銜接 ESI 的細內徑液相層析管柱。 核心觀念 一、ESI 如何將溶液中的分析物轉為氣相離子 ESI 是適合銜接液相層析的大氣壓游離技術。樣品溶液由金屬毛細管尖端流出，在高電場作用下形成帶電噴霧。氮氣可協助霧化與溶劑揮發。溶劑逐漸減少後，液滴縮小，表面電荷密度上升，電荷間的庫侖排斥力促使液滴分裂。經持續去溶劑化及離子釋出，最後得到可進入質譜儀的氣相離子。 作答時抓住「高電場形成帶電液滴、氮氣協助揮發、電荷排斥造成液滴分裂」這條主線即可。不同大小的分析物，其氣相離子形成可涉及不同模型，不宜把所有分析物都限定為完全相同的微觀過程。 ESI 的噴霧毛細管與 APCI 的放電針不可混淆。大氣壓化學游離法（APCI）利用放電針進行電暈放電，產生試劑離子，再經離子－分子反應使分析物游離。若選項以「放電針使分析物游離」描述 ESI，即為錯誤敘述。 比較項目ESI（電灑）APCI（大氣壓化學游離） 游離關鍵高電壓毛細管形成帶電液滴，液滴分裂釋出離子放電針電暈放電產生試劑離子，再與分析物反應 樣品狀態溶液中的離子直接轉為氣相溶液先受熱氣化，再於氣相游離 多重帶電常見，適合蛋白質、抗體以單電荷為主，較適合中小分子 二、正負離子模式、加成與軟性游離 金屬毛細管施加正電壓時，產生並分析帶正電離子；施加負電壓時，產生帶負電離子。正離子模式常見分析物接受質子形成 [M＋H]+，負離子模式則常見失去質子形成 [M－H]−。因此，ESI 並非只能產生正離子。 離子形成方式常見表示判讀重點 質子化[M＋H]+、[M＋zH]z+蛋白質可接受多個質子，形成多重電荷。 去質子化[M－H]−常見於負離子模式。 鈉、鉀離子加成[M＋Na]+、[M＋K]+分析物與溶液中的離子結合，使質量增加；在相同電荷下，質荷比高於對應的質子化離子。 ESI 常見與分析物形成複合離子的是H+、Na+、K+。Ca2+ 相較之下最不常見。這是相對頻率的比較，不能延伸為鈣離子絕對無法與分析物結合。 ESI 屬於軟性游離，通常能保留完整分子相關離子，不以將分析物裂解成多種碎片為特色。需要結構碎片時，可在串聯質譜中選取前驅離子，再誘導解離。大量碎片是電子撞擊游離法（EI）等硬性游離的特徵。 三、多重帶電為何適合蛋白質與抗體 蛋白質、多肽與抗體具有多個可接受質子的部位，因此同一分子可形成一系列不同電荷數的離子，例如 [M＋10H]10+、[M＋11H]11+。這一串峰稱為電荷態分布，不表示樣品中存在多種不同分子量的蛋白質。 質譜橫軸是質荷比 m/z，不是中性分子的分子量。對同一蛋白質而言，電荷數越多，m/z 越小。因此多重帶電可使高分子量分析物落入儀器可量測的 m/z 範圍。 以 LC-MS 分析單株抗體、多肽等大分子藥物時，應優先選擇 ESI。其他游離法較不適合，原因如下： EI：須將樣品氣化，且容易產生大量碎片，適用於可氣化的小分子。 CI：同樣須在氣相中游離，不適合不揮發的大分子。 APCI：須先受熱氣化，以單電荷離子為主，較適合中、小極性分子。 若選項比較 APCI 或 ESI 分別搭配 TOF 或四極柱，分析抗體與多肽等大分子時應選ESI／TOF MS。ESI 提供完整分子的多重帶電離子；飛行時間質量分析器（TOF）質量範圍寬廣，且解析度與質量準確度較佳。四極柱也能搭配 ESI 使用，但在比較題中以 ESI／TOF 最適合。 四、由相鄰電荷態峰計算分子量 設中性蛋白質分子量為 M，接受 z 個質子，質子質量以 h 表示，則： m/z＝（M＋zh）／z＝M／z＋h因此，M＝z（m/z－h）。 精確計算時，h 約為 1.0073 Da。選項差距很大的國考估算題，通常可取 h≈1。不要把觀察到的 m/z 直接當成 M，也不要忽略多個質子帶來的質量。 若已確認兩峰屬於同一蛋白質、相鄰電荷態，且均為質子化離子，令較小 m/z 為 x，較大 m/z 為 y。較小的 x 帶 z＋1 個電荷，較大的 y 帶 z 個電荷： x＝M／（z＋1）＋hy＝M／z＋hz＝（x－h）／（y－x）M＝z（y－h）＝（z＋1）（x－h） 從圖上讀出兩個相鄰的電荷態峰。 以較小峰值減 1，再除以兩峰間距，求得較大 m/z 峰的電荷數 z。 將 z 取最接近的整數，代回 M＝z（y－1）。 若圖上有其他電荷態峰，可代入檢查是否得到相同分子量，再選最接近的選項。 例一：相鄰兩峰約為 1001 與 1063.5。z＝（1001－1）／（1063.5－1001）＝1000／62.5＝16，M＝16×（1063.5－1）＝17000 Da。其中 1063.5 為 16 價，1001 為 17 價。 例二：相鄰兩峰約為 924.1 與 1001。z＝（924.1－1）／（1001－924.1）＝923.1／76.9≈12，M＝12×（1001－1）＝12000 Da。其中 1001 為 12 價，924.1 為 13 價。 例一與例二的較大峰 m/z 相近，算出的分子量卻不同。可見分子量取決於兩峰間距所決定的電荷數，不能只看單一峰值猜答案。實際圖譜須依圖上標示讀值。 另須區分相鄰電荷態峰與同一電荷態的同位素峰。前者用上述公式推算分子量；後者的相鄰峰間距約為 1／z，只用來判斷電荷數，兩種間距不能混用。 五、LC 管柱內徑與 ESI 銜接 流入 ESI 的溶劑量會影響去溶劑化與游離效果，流速過大時游離效率下降。管柱內徑越小，維持適當線速度所需的體積流速越低，因此越容易直接銜接 ESI。 內徑選項須先換算單位：0.21 cm＝2.1 mm，0.46 cm＝4.6 mm，2.54 cm＝25.4 mm，10.16 cm＝101.6 mm。2.1 mm 屬窄徑分析管柱，在最適流速下可直接以 ESI 游離，是這組選項的正確答案。4.6 mm 為傳統分析管柱，所需流速較大，常需分流；25.4 mm 以上屬製備級管柱，不適合直接銜接。 常考陷阱 「ESI 透過放電針使分析物離子化」：錯。放電針是 APCI 的機制；ESI 靠高電壓毛細管形成帶電液滴。 「ESI 透過氮氣吹拂協助揮發」「內部電荷互斥使液滴分裂」：皆為正確敘述，不要誤判為錯。 「ESI 可將分析物裂解為多種離子碎片」：錯。ESI 是軟性游離，主要得到完整分子相關離子。 「ESI 只能產生正離子」：錯。毛細管施加負電壓即可產生負離子。 「分析物與溶液中離子結合而增加質荷比」：正確，例如 Na+、K+ 加成使質量增加。但若電荷數也增加，m/z 不一定變大。 「Ca2+ 常與分析物形成複合離子」：錯。常見的是 H+、Na+、K+，Ca2+ 最不常見。 「抗體分析選 APCI、EI 或 CI」：錯。大分子、不揮發、易熱分解的樣品應選 ESI；儀器組合選 ESI／TOF。 「峰越往右，電荷越多」：相反。同一蛋白質中，右側 m/z 較大，電荷數較少。 「直接把某個峰的 m/z 當成分子量」或「忘記扣除質子質量」：都會選錯，必須先求 z，再算 M＝z（m/z－1）。 「任意兩峰都能套相鄰峰公式」：須確認為同一分析物、相差一個電荷的相鄰峰。 「內徑越大，ESI 效果越好」或「0.21 cm 是 0.21 mm」：錯。內徑越小越適合；公分換毫米須乘以 10。 記憶口訣 「電場成霧、氮氣助乾、電斥裂滴；放電針是 APCI。」 「軟性游離不碎片，正負電壓都能電；氫鈉鉀常加，鈣最少見。」 「小峰減一除峰差，算出大峰電荷價；大峰減一乘電價，蛋白分子量到家。」此口訣採質子質量約為 1，只適用相鄰、純質子化的電荷態峰。 「抗體多肽選 ESI 配 TOF；管柱要細，2.1 毫米最合 ESI。」