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學習重點 掌握反應順序：三酸甘油酯先由lipase水解成甘油與脂肪酸，再經甘油磷酸化、氧化及呈色反應完成定量。 分清酵素功能：glycerol kinase使甘油磷酸化；glycerol-3-phosphate oxidase產生過氧化氫；peroxidase利用過氧化氫進行呈色。 辨認游離甘油干擾：血清原有的游離甘油也會參與後續反應，使未校正的三酸甘油酯結果偏高。 理解空白校正：以不含lipase、保留後續反應酵素的樣本空白測得游離甘油訊號，再由完整反應訊號扣除。 認識另一種甘油測定法：glycerol kinase、pyruvate kinase及lactate dehydrogenase可組成偶合反應，藉NADH消耗量測定甘油。 核心觀念 一、三酸甘油酯酵素呈色法的完整流程 血清三酸甘油酯（triglyceride，TG）的常用酵素法，是先將TG水解，再利用所釋出的甘油產生可測量的呈色訊號。第一步是水解，不是氧化或還原；最先釋出的甘油是後續定量的起點。 步驟酵素反應與判讀重點 水解TG脂酶（lipase）TG與水反應，生成甘油及脂肪酸。完全水解時，每分子TG可釋出一分子甘油及三分子脂肪酸。 甘油磷酸化甘油激酶（glycerol kinase，又稱glycerokinase）甘油＋ATP → glycerol-3-phosphate＋ADP。 氧化glycerol-3-phosphate oxidase使glycerol-3-phosphate氧化，生成磷酸二羥丙酮及過氧化氫（H2O2）。 呈色過氧化酶（peroxidase）利用H2O2氧化呈色試劑，形成有色產物，再測定吸光度。 在反應條件適當且干擾經校正的情況下，呈色強度與TG濃度成正比。ADP屬於甘油磷酸化步驟的產物，H2O2則在後續氧化步驟形成，都不是TG水解的第一批產物。 此常用呈色系統包含lipase、glycerol kinase、glycerol-3-phosphate oxidase及peroxidase，不需要腺苷酸激酶（adenylate kinase）。不要因反應中出現ATP與ADP，就推論一定要加入adenylate kinase。 二、oxidase與dehydrogenase不能混用 名稱相近的glycerol-3-phosphate oxidase與glycerol-3-phosphate dehydrogenase，所連結的偵測訊號不同。判斷關鍵是產生H2O2，還是涉及NADH的變化。 比較項目氧化酶途徑NAD依賴型脫氫酶途徑 關鍵酵素glycerol-3-phosphate oxidaseglycerol-3-phosphate dehydrogenase 氧化甘油磷酸時的訊號產生H2O2使NAD＋還原成NADH 後續偵測由peroxidase催化呈色測定NADH的吸光度變化 因此，「glycerol-3-phosphate dehydrogenase作用後生成過氧化氫」是錯誤搭配。產生H2O2的是oxidase，利用H2O2使試劑呈色的是peroxidase。 三、游離甘油為何造成TG假性偏高 未做游離甘油校正時，完整反應測得的甘油有兩個來源：一是TG經lipase水解後釋出的甘油，二是血清原本就存在的游離甘油。後者不必經lipase處理，便能直接進入glycerol kinase及後續反應，產生額外呈色訊號。 所以，游離甘油雖然不是TG，仍會被計入TG的測定結果，造成正偏差，也就是假性偏高。脂肪酸雖然同為TG水解產物，卻不會沿這條甘油反應鏈產生相同訊號；本測定最須辨認的干擾物是甘油。 含甘油的藥物或製劑可增加血中游離甘油。若短時間內TG檢驗值突然明顯上升，應將近期用藥納入判讀；血糖變化不大，也不能排除這種干擾。檢驗值升高不一定代表體內TG真的等幅增加。 真性高TG可能伴隨血清混濁或乳糜樣外觀，但外觀也受脂蛋白組成影響，不能單靠澄清或混濁判定濃度。游離甘油造成的假性升高，可能沒有相應的乳糜外觀。 四、不含lipase的樣本空白如何校正 消除游離甘油干擾，可將樣本分別進行完整反應與甘油空白反應。兩組的關鍵差異是有沒有加入lipase。 反應組別試劑配置測得的訊號來源 完整測定組含lipase及後續反應酵素TG水解產生的甘油＋原有游離甘油。 甘油空白組不含lipase，保留glycerol kinase、glycerol phosphate oxidase及peroxidase原有游離甘油；TG未被水解，不能提供相應的甘油訊號。 完整測定組訊號－甘油空白組訊號＝來自TG的訊號。空白組必須保留甘油後續反應所需酵素，才能測出原有游離甘油的貢獻；若移除glycerol kinase、oxidase或peroxidase，就無法依此呈色反應完整測得甘油訊號。 此處sample blank的主要目的，是扣除游離甘油干擾，不能概括成可同時消除膽紅素、溶血或抗壞血酸等所有干擾。 五、以NADH消耗量測定游離甘油 glycerol kinase／pyruvate kinase／lactate dehydrogenase是另一組可用來測定甘油的偶合酵素系統： glycerol kinase：甘油＋ATP → glycerol-3-phosphate＋ADP。 pyruvate kinase：利用ADP與磷酸烯醇丙酮酸反應，生成ATP及丙酮酸。 lactate dehydrogenase：將丙酮酸還原成乳酸，同時使NADH氧化成NAD＋。 因此可藉NADH的消耗量推算甘油含量。這組反應未包含TG水解步驟時，測的是游離甘油；若要用於TG定量，仍須先釋出TG中的甘油，並考慮原有游離甘油的影響。 六、與膽固醇測定的區別 TG測定加入lipase，是為了釋出甘油。總膽固醇測定通常先以cholesterol esterase水解膽固醇酯，再由cholesterol oxidase等反應測量膽固醇；游離膽固醇測定則不需先水解膽固醇酯。兩者都不以lipase水解TG作為定量起點。 常考陷阱 「第一步氧化TG形成甘油磷酸」：錯。先由lipase水解出甘油，再由glycerol kinase使甘油磷酸化。 「水解後生成游離TG與脂肪酸」：錯。TG是受水解的原料，產物是甘油與脂肪酸。 「最先形成ADP、H2O2或NADH」：錯。完整TG測定流程先釋出甘油；其他訊號出現在後續步驟。 「dehydrogenase產生H2O2」：錯。須分清oxidase與dehydrogenase，不能只看中文都有氧化相關作用。 「甘油空白應去掉glycerol kinase」：錯。要去掉的是lipase，讓空白組只反映原有游離甘油。 「含甘油藥物使TG結果偏低」：錯。未校正時會增加呈色訊號，使結果偏高。 「TG法需要adenylate kinase」：錯。常用呈色反應使用的是glycerol kinase，勿將兩種激酶混淆。 「甘油的偶合反應都會產生NADH」：錯。glycerol kinase／pyruvate kinase／lactate dehydrogenase系統是消耗NADH。 記憶口訣 「脂酶拆、甘油磷、氧化產過氧、過氧酶顯色。」 「甘油多，TG高；空白少脂酶，相減才可靠。」