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學習重點 凝膠過濾依分子大小分離：大分子較難進入膠粒孔洞，較早洗脫；小分子可進入較多孔洞，較晚洗脫。 蛋白質須以天然存在的完整分子判斷：比較大小時，應注意多聚體與單一次單元的差別；凝膠過濾也可配合標準蛋白估測分子量。 圖譜位置與面積用途不同：滯留時間可輔助定性，峰面積配合校正曲線可計算含量。 解析度代表相鄰峰的分離程度：增加柱長、選用適當填充物及調整移動相可改善分離；提高流速不保證提高解析度。 核心觀念 一、凝膠過濾的孔隙排阻原理 凝膠過濾又稱膠體過濾、膠濾或大小排阻層析。管柱填充多孔性膠粒，分子能進入多少孔隙，決定其在管柱內可分布的空間與洗脫位置。理想情況下，分離主要依據分子大小，不依靠蛋白質與固定相的吸附作用。 大分子：較難進入孔洞，主要隨流動相通過膠粒之間的空間，因此較早洗脫。 小分子：可進入較多孔洞，在管柱內可分布的空間較大，因此較晚洗脫。 超過排阻範圍的分子：均無法進入孔洞，可能一起很早洗脫，不能再靠此管柱有效區分大小。 凝膠過濾實際反映的是水動力學大小，亦即分子在溶液中的有效大小，因此分子形狀與聚合狀態也會影響結果。一般考題若僅提供蛋白質分子量，且沒有特殊條件，便依分子量由大到小排列洗脫順序。例如210、155、105、62 kDa的蛋白質，依此順序先後洗脫；判斷第二個洗脫者，就是找第二大的分子。 不要把凝膠過濾想成以濾膜截留大分子的操作。此處大分子雖不能進入膠粒孔洞，仍可從膠粒間的空間通過，所以會先離開管柱。 二、常見血漿蛋白的大小與洗脫順序 比較蛋白質時，要以分析條件下的完整天然分子判斷，不能只看單一胜肽鏈。常見血漿蛋白可整理如下： 蛋白質天然狀態與約略分子量比較重點 C反應蛋白（CRP）通常為五聚體，約115 kDa在此組蛋白質中最大，最早洗脫 運鐵蛋白（transferrin）約80 kDa比白蛋白大，較早洗脫 白蛋白（albumin）約66 kDa介於運鐵蛋白與前白蛋白之間 前白蛋白（prealbumin）即轉甲狀腺素蛋白，天然四聚體約55 kDa不能以單一次單元的分子量代替完整分子量 依上述典型天然分子大小，洗脫順序為C反應蛋白→運鐵蛋白→白蛋白→前白蛋白。前白蛋白的名稱來自其電泳遷移位置，不能據此推論它在凝膠過濾中一定比白蛋白先洗脫。 三、利用凝膠過濾估測分子量 選擇分離範圍適當的凝膠過濾管柱，以已知分子量的標準蛋白建立校正曲線，再將未知蛋白的洗脫體積或洗脫位置與曲線比較，即可估測分子量。在適當分離範圍內，分配係數或洗脫體積與分子量對數可呈近似線性關係。 這是以大小為基礎的估測，分子形狀、聚合狀態或非特異性吸附都可能造成偏差。天然多聚體若在分析中維持完整，所得結果反映完整複合體的表觀分子量，而非各次單元的分子量。 層析方法主要分離依據 凝膠過濾分子大小，可配合標準品估測分子量 離子交換蛋白質與帶電固定相的作用差異 親和力層析與特定配體的專一性結合 羥磷灰石層析蛋白質與羥磷灰石表面的作用差異 若要從不同層析管柱中選出適合測定蛋白質分子量者，應掌握凝膠過濾依大小分離這項特徵。 四、層析圖譜的定性與定量 層析圖通常以時間為橫軸、偵測器訊號為縱軸。滯留時間是樣品注入後至該峰峰頂出現所經過的時間；峰面積則是峰訊號對時間積分的結果。 定性看滯留時間：在相同分析條件下，比較未知物與標準品的滯留時間，可作為辨識依據。但不同物質仍可能同時洗脫，不能只憑時間相同就斷定為同一物質。 定量看峰面積：在偵測器適當的線性範圍及相同分析條件下，以標準品建立峰面積與濃度或進樣量的校正關係，再計算未知物含量；有稀釋時還須換算稀釋倍數。 管柱溫度與移動相流速是操作條件，不是直接代表待測物含量的訊號。兩份樣品即使滯留時間相同，也可能有不同峰面積與濃度；同一個峰也可能包含未被分開的多種物質。 五、解析度與改善分離的方法 解析度表示相鄰兩個峰分開的程度，取決於峰間距離及峰寬。峰距愈大、峰愈窄，通常分離愈好。若以基線峰寬計算，可表示為： Rs＝2×（後峰滯留時間－前峰滯留時間）／（前峰基線寬度＋後峰基線寬度） 調整因素對解析度的影響與判斷 增加管柱長度其他條件相同時，可增加理論板數並改善解析度，但分析時間與背壓也會增加 更換填充物或固定相可改善柱效或改變選擇性，使原先接近的成分較容易分開 改變移動相組成可改變保留程度與選擇性；適當調整溶劑比例、pH等條件可能改善分離 增加流動相流速不能視為提高解析度的通則；流速過高可能因傳質不及而使峰變寬、柱效下降 流速存在適當範圍，效果與原先操作位置有關。因此考試比較改善解析度的方法時，單純增加流速不是可靠的改善措施。流得快代表分析可能較快完成，並不代表相鄰峰分得更清楚。 常考陷阱 「小分子先洗脫」：把孔隙排阻原理記反；小分子進入孔洞較多，所以較晚洗脫。 「依酸鹼性、電荷或親和力決定膠濾順序」：凝膠過濾主要依分子大小；上述性質不是本法的主要分離依據。 「前白蛋白一定比白蛋白先出來」：名稱反映電泳位置，不能套用到凝膠過濾。 「用單一次單元分子量比較天然蛋白」：須先注意是否為多聚體；天然CRP通常為五聚體，前白蛋白為四聚體。 「滯留時間愈長，含量愈多」：時間主要協助定性；定量應以峰面積配合校正曲線判斷。 「流速愈快，解析度愈高」：流速過高可能降低柱效；提高分析速度與改善分離是不同概念。 「換管柱或移動相必定改善解析度」：這些是可調整的改善方向，仍須選擇適當條件，並非任意更換都有效。 記憶口訣 膠濾大先小後，天然聚體看完整；定性看時間，定量看面積；柱長、填料、移動相，流速適當別求快。