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學習重點 墨點法三大配對：Southern 偵測 DNA、Northern 偵測 RNA、Western 偵測蛋白質；特定 mRNA 的偵測選 Northern。 掌握 Western blot 流程：先進行蛋白質電泳，再轉膜、封閉、抗體反應與訊號偵測。 區分核酸與蛋白質檢測：亞硫酸氫鹽處理分析 DNA 甲基化；RT-PCR 偵測核酸；RIA、ELISA、免疫組織化學可偵測蛋白質抗原。 分清生理功能與研究用途：限制酶的天然功能是切割進入細菌的外來 DNA；質譜儀是蛋白體學的重要分析工具。 辨認交互作用分析：SPR、免疫共沉與適當設計的親和層析可研究蛋白質交互作用；陰離子交換層析本身不能證明交互作用。 核心觀念 一、墨點法的檢測對象與判讀 典型的 Southern、Northern 與 Western blot，皆先以凝膠電泳分離樣本，再將目標轉移至膜上，利用具專一性的探針或抗體偵測。電泳負責分離，轉膜方便後續反應，探針或抗體則負責辨認特定目標。 方法主要對象辨認方式主要資訊 Southern blot，南方墨點法DNA互補核酸探針雜交特定 DNA 序列及片段大小 Northern blot，北方墨點法RNA，包括 mRNA互補核酸探針雜交特定轉錄本的大小及相對含量 Western blot，西方墨點法蛋白質專一性抗體辨認抗原目標蛋白的表觀分子量及相對含量 Eastern blot 的名稱與用途並不統一。在本單元採用的傳統分類中，若要求從四個方位名稱中找出不屬於核酸或蛋白質分析的墨點法，應選東方墨點法。部分文獻另以 Eastern blot 指蛋白質翻譯後修飾分析，因此不要將它背成與前三者同樣固定的一對一分類。 二、Northern blot 與其他核酸分析方法 Northern blot 將 RNA 電泳分離並轉膜，再以互補的標記核酸探針偵測目標。因此，看到分析 RNA、偵測特定 mRNA、比較轉錄本大小或相對含量，都應優先聯想到 Northern blot。它可直接分析 RNA，不必先反轉錄成 DNA。 凝膠位移分析（gel shift assay、EMSA）：利用蛋白質與核酸結合後，複合體在凝膠中的移動速率改變，研究蛋白質與 DNA 或 RNA 的結合。 雙脫氧鏈終止法：即 Sanger 定序，主要用於判讀 DNA 序列。 RT-PCR：先將 RNA 反轉錄成互補 DNA，再以 PCR 擴增。分析的是核酸，不能直接測得蛋白質含量。 三、Western blot 與蛋白質免疫偵測 Western blot 通常先製備蛋白質樣本，以 SDS-PAGE 分離，再轉移至 PVDF 或硝酸纖維素膜，經封閉後加入辨認目標蛋白的一級抗體，並常以帶有標記的二級抗體產生可偵測訊號。 基本順序是蛋白質電泳 → 轉膜 → 封閉 → 抗體反應 → 訊號偵測。在電泳與水解等操作之間判斷先行步驟時，應選蛋白質電泳。蛋白質水解會切斷胜肽鏈，並非一般 Western blot 的必要起始操作。 方法原理與用途 RIA，放射免疫分析利用抗原抗體反應與放射性標記進行偵測，可測定蛋白質抗原。 ELISA，酵素連結免疫吸附分析利用抗原抗體反應及酵素產生的訊號偵測目標。 免疫組織化學染色利用抗體在組織切片中辨認抗原，呈現蛋白質的分布與位置。 RT-PCR，反轉錄聚合酶連鎖反應反轉錄並擴增核酸，不能直接偵測蛋白質。 mRNA 表現量與蛋白質含量可能受到轉譯效率、蛋白質降解等因素影響，測到 mRNA 不等於直接證實蛋白質表現量。 四、亞硫酸氫鹽處理與 DNA 甲基化 亞硫酸氫鹽處理（bisulfite treatment）用於分析DNA 甲基化。未甲基化的胞嘧啶經處理後轉為尿嘧啶，經 PCR 擴增後對應為胸腺嘧啶；5-甲基胞嘧啶在標準處理下則大致保留。 利用處理後序列中 C 與 T 的差異，可搭配定序或甲基化特異性 PCR 分析甲基化狀態。判斷關鍵是胞嘧啶是否因甲基化而呈現不同的轉換結果，不是磷酸化、乙醯化或醣化分析。 五、限制酶的天然防禦功能 限制酶能辨認特定 DNA 序列並切割 DNA。在細菌的限制與修飾系統中，其生理功能是分解進入細菌的外來 DNA，例如噬菌體 DNA；自身 DNA 則可藉相應的甲基化修飾受到保護。 研究者利用限制酶製備 DNA 片段，進行基因選殖與重組 DNA 研究，這是人為應用。限制酶不是用來限制細菌 DNA 的長度，也不是使細菌產生抗生素抗藥性的主要機制。 六、蛋白體學與質譜儀 蛋白體學研究特定細胞、組織或條件下的蛋白質組成、含量、修飾與功能。質譜儀（mass spectrometry）是重要工具，可分析離子的質荷比，搭配胜肽碎裂資訊與資料庫比對，鑑定蛋白質及部分翻譯後修飾。 Western blot 適合驗證特定目標蛋白；流式細胞儀常分析細胞特徵與標記；核磁共振可研究分子結構。若問蛋白體學最具代表性的檢測儀器，應選質譜儀。 七、蛋白質交互作用分析 方法原理與判斷重點 表面電漿共振法（SPR）將一方固定於感測表面，監測另一方結合與解離，可研究結合動力學及親和力。 免疫共沉法（Co-IP）以抗體捕捉目標蛋白，檢查是否同時拉下其他蛋白，支持它們存在於同一複合體。 親和層析法將誘餌蛋白或配體固定於基質，捕捉可特異性結合的蛋白；適當設計與對照可支持交互作用。 陰離子交換層析法利用帶正電的基質結合帶負電的分子，依電荷差異分離；本身不能證明蛋白質彼此結合。 共同洗脫不等於彼此交互作用；共同沉澱也未必代表直接結合。Co-IP 可能捕捉到由其他蛋白橋接的複合體，解讀時須區分「同一複合體」與「兩者直接接觸」。 常考陷阱 將南方與北方顛倒：Southern 對 DNA，Northern 對 RNA；特定 mRNA 仍屬 RNA。 將 Western 的先行操作寫成核酸電泳或蛋白質水解：基本流程先以蛋白質電泳分離，再轉膜偵測。 把 RT-PCR 當成蛋白質檢驗：它偵測 RNA 所轉錄而來的 DNA，不能直接證實蛋白質含量。 把亞硫酸氫鹽與其他修飾混淆：本單元要連結 DNA 甲基化與胞嘧啶轉換。 把限制酶的研究用途當成生理功能：重組 DNA 是應用，切割外來 DNA 才是天然防禦功能。 認為所有層析都能證明交互作用：親和捕捉利用特異性結合；陰離子交換只依電荷分離。 以單一蛋白偵測取代蛋白體學：Western 適合目標驗證，大量蛋白質鑑定應聯想到質譜儀。 將 Eastern 當成固定的蛋白質檢測答案：本單元四方墨點分類依南 DNA、北 RNA、西蛋白掌握；排除核酸與蛋白質分析時選東方。 記憶口訣 「南 DNA，北 RNA，西方蛋白靠抗體。」 「亞硫看甲基，限制切外來；蛋白體找質譜，電荷分離非互作。」