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學習重點 掌握重氮反應法（diazo reaction）測定胆紅素的原理，理解直接反應與間接反應的差別。 熟記α、β、γ、δ 四種膽紅素分畫的結構、是否需要加速劑，以及能否出現於尿液。 了解咖啡因、醇類與尿素的加速作用，並區分總膽紅素、直接膽紅素與間接膽紅素的測定方式。 掌握膽紅素檢體的避光原則，以及羊水膽紅素450 nm 與 ΔOD450的意義。 核心觀念 一、重氮反應法：以顏色變化測定胆紅素 膽紅素可與重氮試劑（diazo reagent）反應，產生有色的偶氮膽紅素（azobilirubin），再利用比色法測定吸光度，以求得膽紅素濃度。因此，遇到重氮反應的測定對象，應聯想到bilirubin，而不是 ALD、GLDH 或 sphingomyelin。 重氮反應產物的測定波長會隨試劑配方、酸鹼條件及方法而改變，不能把所有血清膽紅素重氮法都記成同一波長。羊水膽紅素所考的 450 nm，則是利用膽紅素本身的光吸收特性，須與重氮反應產物的比色測定區分。 直接與間接是依膽紅素在指定條件下與重氮試劑的反應性質分類。接合膽紅素水溶性較高，可直接反應；未接合膽紅素水溶性低，通常須加入加速劑，才能充分進行反應。 二、膽紅素四種分畫：α、β、γ、δ 分畫 化學型態與性質 重氮反應與加速劑 尿液中的表現 α-bilirubin 未接合膽紅素，未與葡萄糖醛酸接合；在血中主要與白蛋白以非共價方式結合。 屬間接反應型，需咖啡因等加速劑協助。 通常不經腎絲球濾出，不形成一般所稱的膽紅素尿。 β-bilirubin 單葡萄糖醛酸膽紅素，屬接合膽紅素，水溶性較高。 可直接反應，不需藉咖啡因使其反應。 可出現於尿液。 γ-bilirubin 雙葡萄糖醛酸膽紅素，屬接合膽紅素。 可直接反應，不需咖啡因加速。 可出現於尿液。 δ-bilirubindelta-bilirubin 膽紅素與白蛋白形成共價結合。 具有直接反應性，常規直接膽紅素測定通常將其計入。 因與白蛋白共價結合，通常不經腎絲球濾出。 分畫判斷的重點是：α 為未接合型；β、γ 為接合型；δ 為白蛋白共價結合型。不能將 γ-bilirubin 與 delta-bilirubin 混為一談，也不能說 α-bilirubin 已與葡萄糖醛酸接合。 「與白蛋白結合」必須再辨別結合方式：α-bilirubin 主要是非共價結合，δ-bilirubin 才是共價結合。此外，直接膽紅素並不完全等同於可由尿液排出的膽紅素，因為直接反應分畫還包含 δ-bilirubin。 三、加速劑的功能與常見試劑 未接合膽紅素難溶於水，因此與水相中的重氮試劑反應不易。加速劑的主要功能是增加膽紅素的有效溶解度，使未接合膽紅素能充分參與反應。考試判斷應選「增加溶解度」，而不是改變分子共價結構、提高分子動能或單純調整 pH。 咖啡因（caffeine）：常用於促進未接合膽紅素反應，是總膽紅素重氮法的重要試劑。 乙醇、甲醇：可作為促進未接合膽紅素反應的醇類試劑。 尿素：亦可用於協助未接合膽紅素與重氮試劑反應。 維生素 C：不是未接合膽紅素測定的加速劑；其還原性可能干擾部分重氮法，使顯色減少、結果偏低。 因此，「需要加入醇類、咖啡因或尿素才與重氮試劑反應」所描述的就是間接膽紅素，也就是未接合膽紅素、α-bilirubin。 Sodium benzoate（苯甲酸鈉）須依完整試劑配方判讀。本單元所列「血清加入 sodium benzoate，再以 diazo 試劑測定」的試劑情境，對應直接膽紅素。但不可將此延伸為苯甲酸鈉只會用於直接膽紅素法；它也可存在於咖啡因與苯甲酸鈉組成的總膽紅素試劑中。判讀時須注意有無咖啡因及整體反應條件。 四、總膽紅素、直接膽紅素與間接膽紅素 總膽紅素：典型重氮法加入咖啡因等加速劑，使原本不易反應的未接合膽紅素也能參與反應。 直接膽紅素：在不使用使未接合膽紅素充分反應的加速條件下，測定可直接反應的部分，主要包含接合膽紅素及 δ-bilirubin。 間接膽紅素：常規檢驗通常以總膽紅素減去直接膽紅素求得；若要讓未接合膽紅素本身參與重氮反應，則須加入適當加速劑。 應區分「讓間接膽紅素反應所需的試劑」與「臨床報告如何取得間接膽紅素數值」：前者重點是咖啡因等加速劑，後者通常是差值計算，不能把加入咖啡因後測得的全部顏色直接視為間接膽紅素。 五、檢體處理：膽紅素特別怕光 膽紅素對環境中的光線特別敏感。光照可造成光分解、光氧化等變化，使可測得的膽紅素減少，通常導致結果偏低。 血清與羊水等膽紅素檢體均應避光保存與運送，可使用避光容器或以不透光材料包覆，並儘速分析。比較光線、溫度、壓力及酸鹼值時，本單元的判斷關鍵是光線。 六、羊水膽紅素與 ΔOD450 羊水膽紅素可利用光學比色或分光光度分析，關鍵波長為450 nm。羊水的 ΔOD450，是指實測吸收曲線在 450 nm 的吸光度，高於推估背景基線的差值，用以反映膽紅素造成的額外吸收。 ΔOD450 並非單純將 450 nm 吸光度減去某一固定波長的讀值。背景應依吸收曲線建立，不能將其他波長直接當成所有方法通用的扣除值。 羊水膽紅素增加可反映胎兒溶血，ΔOD450 傳統上用於評估胎兒溶血性疾病，判讀須配合孕週。作答時先掌握羊水膽紅素選 450 nm、檢體必須避光兩項重點。 常考陷阱 「α-bilirubin 與白蛋白共價結合」：錯。α 主要為非共價結合；共價結合者是 δ。 「α-bilirubin 已與葡萄糖醛酸接合」：錯。α 是未接合型；β、γ 才是接合型。 「γ-bilirubin 需加入咖啡因才能反應」：錯。γ 是雙葡萄糖醛酸型，可直接反應。 「β-bilirubin 可以出現於尿液」：正確。β 屬水溶性較高的接合膽紅素。 「咖啡因主要用來改變 pH 或提高分子動能」：錯。主要考點是增加未接合膽紅素的溶解度。 「維生素 C 可取代咖啡因作為加速劑」：錯。維生素 C 不是此用途的加速劑。 「加入咖啡因後只測到間接膽紅素」：錯。典型總膽紅素法加入咖啡因，是為了讓未接合部分也能反應。 「直接膽紅素全部都能從尿液排出」：錯。δ-bilirubin 具有直接反應性，但與白蛋白共價結合，通常不被濾出。 「羊水膽紅素選 550 或 600 nm」：錯。關鍵波長是 450 nm。 記憶口訣 α 未合、β 單合、γ 雙合、δ 黏白蛋白；未合加咖啡，增溶助反應；膽紅素要避光，羊水記四五〇。