阿摩線上測驗
登入
阿摩線上測驗
登入
學習重點 掌握還原型輔酶的訊號：NADH、NADPH 在 340 nm 有明顯吸光；生成時吸光上升，消耗時吸光下降。 活性測定看恆定初始速率：使用飽和受質，在反應直線期測量吸光變化速率，避免遲滯期與受質耗盡期。 分清偶合指示酵素：ALT 常接 LDH，AST 主要接蘋果酸脫氫酶；「可以使用」與「必須使用」的判斷不同。 排除干擾並維持測定條件：GLD 測定加入 Oxamate 抑制 LDH；反應過快須稀釋重測，檢體保存則須考慮酵素穩定性。 區分測定目標：動力學法既可測酵素活性，也可利用酵素反應速率測定鈉離子等物質濃度。 核心觀念 一、NADH、NADPH 的測定波長與吸光方向 NAD⁺、NADP⁺是氧化型；NADH、NADPH 是還原型。還原型在 340 nm 有明顯吸光，氧化型在此波長的吸光可忽略，因此可利用兩者的差異追蹤反應。 反應方向340 nm 吸光值變化判讀 NAD⁺ → NADH；NADP⁺ → NADPH上升還原型輔酶生成 NADH → NAD⁺；NADPH → NADP⁺下降還原型輔酶消耗 NADH 並非在 260 nm 沒有吸光，而是NADH 與 NAD⁺ 都會在 260 nm 吸光。當 NADH 被氧化時，生成的 NAD⁺ 也貢獻吸光，會干擾對 NADH 消耗的判讀。因此應選 340 nm，不能將原因記成「260 nm 完全不吸光」。 葡萄糖的己糖激酶法可先形成葡萄糖-6-磷酸，再由葡萄糖-6-磷酸脫氫酶使 NADP⁺ 還原成 NADPH。此時測量的是NADPH 在 340 nm 的吸光增加，並非 NADP⁺ 本身在此波長的強吸光。 二、動力學法：在直線期測恆定初始速率 動力學法以單位時間的吸光變化量，例如 ΔA/min，反映受質消耗或產物生成速率。在溫度、pH、受質濃度等條件固定時，可將速率換算為酵素活性。 遲滯期：混合、溫度平衡及偶合反應建立穩定速率的階段，曲線可能尚未線性，不宜取用。 直線期：受質充足，吸光值隨時間近似等速變化，應取此區間的斜率。 受質耗盡期：受質降低，反應減慢、曲線彎曲，不能代表原來的初始速率。 一般測定酵素活性時，使用飽和受質濃度，使反應對受質近似零級；在其他條件適當時，速率與酵素量成正比。要測的是受質減少或產物生成的恆定初始速率，不是反應終點吸光值，也不是 Km。 這裡的「初始速率」是指受質尚未明顯消耗時的穩定速率，並非一定從混合後第一秒開始計算；若存在遲滯期，仍應待反應進入直線期後讀值。 若吸光變化速率超出方法允許範圍，酵素可能過多，使受質迅速耗盡。應稀釋檢體後重新分析，並依稀釋倍數換算原檢體活性。主要目的為避免受質耗盡、維持可測量的直線期，不是縮短遲滯期，也不是讓速率與受質濃度成正比。 三、偶合指示反應與 LDH 的角色 主反應若不易直接偵測，可利用其產物接上指示反應，轉成 NADH 或 NADPH 的吸光變化。偶合酵素及所需試劑必須充足，指示反應不可成為速率限制步驟，才能讓訊號反映主反應速率。 LDH 的常用指示方向為： 丙酮酸＋NADH＋H⁺ → 乳酸＋NAD⁺ 因此，主反應產生丙酮酸後，可用 LDH 將它轉為乳酸，並測量 340 nm 吸光下降。 測定對象典型反應與判斷 ALT丙胺酸與 α-酮戊二酸反應，產生丙酮酸與麩胺酸；再接 LDH，測 NADH 消耗。 AST產生草醯乙酸，主要接蘋果酸脫氫酶，使其還原為蘋果酸並消耗 NADH；部分試劑另含 LDH，以處理丙酮酸干擾。 CK有不同偶合法；可採己糖激酶及葡萄糖-6-磷酸脫氫酶系統，也有經丙酮酸激酶再接 LDH 的方法。 ALP常用可產生有色產物的受質，不以 LDH 作為必要指示酵素。 在典型臨床測定配對中，ALT 配 LDH、AST 配蘋果酸脫氫酶。但若只問 LDH「可以應用」於哪種測定，卻未限定反應方向與方法，可能無法形成唯一答案；不能把常用配對推論成其他方法絕不使用 LDH。 四、GLD 測定：以 Oxamate 排除 LDH 干擾 利用 NADH 消耗測定 GLD 時，可採下列反應方向： α-酮戊二酸＋銨離子＋NADH → 麩胺酸＋NAD⁺ 此時 340 nm 吸光下降反映 NADH 消耗。若檢體含有丙酮酸，血清 LDH 也可能消耗 NADH，造成額外吸光下降，使 GLD 活性被高估。 Oxamate 的用途是抑制 LDH，減少此項干擾。它不是 GLD 活化劑，不是用來競爭型抑制 GLD，也不是用來降低檢體混濁度。 五、活性單位、競爭型抑制與檢體保存 1 U（International unit）是在特定測定條件下，每分鐘催化 1 μmol 受質轉化的酵素量；若反應計量關係適當，也可表述為每分鐘生成 1 μmol 產物。溫度、pH 與受質濃度等條件會影響活性，不能省略「特定條件」的概念。 競爭型抑制物與受質競爭酵素活性部位。典型結果為表觀 Km 增加、Vmax 不變；提高受質濃度可減弱抑制效果。但不能反過來認定所有與活性部位結合的抑制作用都屬於可逆競爭型抑制。 檢體保存須依酵素穩定性處理。LDH 部分同功酵素對低溫較不穩定，冷藏可能造成活性下降，因此不能將「無法立即檢驗就保存於 4°C」當作 LDH 的通則。實際保存方式應依檢驗方法與實驗室規範決定，不任意套用固定保存時間。 六、利用酵素動力學測定鈉離子 血鈉的酵素動力學測定可利用β-galactosidase（β-半乳糖苷酶），依鈉離子對其活性的影響，建立反應速率與鈉濃度的關係。此處的待測物是鈉離子，酵素是測量工具；與測定檢體本身的酵素活性不同。 常考陷阱 「NADH 在 260 nm 沒有吸光」：錯在忽略氧化型與還原型都會吸光；340 nm 才適合區分其變化。 「NAD⁺ 或 NADP⁺ 還原後，340 nm 吸光下降」：還原會生成 NADH 或 NADPH，吸光應上升。 「初速率就是遲滯期斜率」：應選受質尚充足的直線期，不能選遲滯期或耗盡期的前段。 「稀釋是為了建立受質的一級動力學」：目的是降低酵素量、避免受質耗盡；飽和受質下對受質近似零級。 「AST 主要由 LDH 指示」：典型 AST 指示酵素為蘋果酸脫氫酶；典型 ALT 才以 LDH 追蹤丙酮酸。 「Oxamate 抑制 GLD」：應記為抑制 LDH，避免額外消耗 NADH。 「所有酵素檢體延遲分析都應冷藏」：不可一概而論，LDH 的低溫不穩定性尤其容易考。 「動力學法測鈉使用 LDH」：應記 β-galactosidase；不要因熟悉 NADH 偶合法就一律選 LDH。 記憶口訣 還原型，三四〇；生成升，消耗降。 飽和看初速，直線才讀值；過快先稀釋，耗盡莫計算。 ALT 接 LDH；GLD 防 LDH，Oxamate 來抑制。