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學習重點 Sanger 法的核心是鏈終止：雙去氧核苷三磷酸（ddNTP）缺少 3′-OH，接入 DNA 鏈後即停止延長。 分清定序技術的分類：Sanger 為第一代定序；焦磷酸反應、離子半導體、奈米孔及單分子定序，均須與傳統 Sanger 法區別。 能偵測突變，不代表就是定序：ARMS 利用等位基因專一性 PCR 偵測特定突變，本身不是定序技術。 掌握 Phred 換算：Q = −10 × log10(p)，Q30 代表錯誤機率為 0.001，即 0.1%，相應正確率為 99.9%。 核心觀念 一、Sanger 法：缺少 3′-OH 就無法繼續延長 Sanger 法又稱雙去氧鏈終止定序法。反應需要 DNA 模板、引子、DNA 聚合酶、一般去氧核苷三磷酸（dNTP），以及少量雙去氧核苷三磷酸（ddNTP）。DNA 聚合酶由引子提供的 3′-OH 開始，讓新生 DNA 鏈沿 5′→3′ 方向延長。 正常延長時，DNA 鏈末端的 3′-OH 參與接入下一個核苷酸，形成磷酸二酯鍵。ddNTP 雖可被聚合酶接入，但其糖環的 3′ 碳上沒有羥基，因此接入後無法再接續下一個核苷酸，造成鏈終止。 不同位置發生鏈終止，會產生長短不同的 DNA 片段。現代常見的 Sanger 定序以螢光標記區分末端鹼基，再經毛細管電泳依片段長短分離，依序判讀新生 DNA 鏈的序列。 反應成分主要功能是否為鏈終止的關鍵成分 dNTP提供正常 DNA 合成原料，接入後仍保有 3′-OH。否，可繼續延長。 ddNTP可接入 DNA 鏈，但缺少 3′-OH。是，接入後終止延長。 DNA 聚合酶催化核苷酸接入。否。 引子提供延長所需的起始位置與 3′-OH。否。 二、去氧與雙去氧：比較基準決定碳位 糖環上的碳以 1′、2′、3′ 等符號標示，以便與鹼基上的位置區分。一般 DNA 的去氧核糖在 2′ 碳上為氫，而不是羥基，但仍保留 3′-OH，可供 DNA 鏈延長。 雙去氧核苷酸的糖環則在 2′ 與 3′ 位置都沒有羥基。因此，若比較的是「一般去氧核苷酸」與「雙去氧核苷酸」，額外缺少羥基的位置就是第三個碳，即 3′ 碳。造成鏈終止的直接原因也是缺少 3′-OH。 三、高通量定序與各種讀序訊號 大量平行定序（massively parallel sequencing）強調同時讀取大量分子或片段。Sanger 屬第一代定序，相較之下通量較低；即使使用自動化儀器，也不因此歸為次世代定序（NGS）。 不同教材對世代的劃分略有差異：奈米孔與部分單分子技術常另稱第三代定序，但在廣義的新世代或高通量定序分類中仍可納入。辨識重點是不要因為名稱有「單分子」，就誤認為只能逐一、低通量地分析。 技術基本原理分類重點 Sanger 定序ddNTP 鏈終止，依片段長短與末端標記讀序。第一代定序，不屬於 NGS。 焦磷酸反應定序pyrosequencing核苷酸接入時釋出焦磷酸，經連鎖酵素反應產生發光訊號。屬定序技術，曾用於高通量定序平台。 離子半導體定序ion semiconductor sequencing偵測核苷酸接入時釋出的氫離子所造成的酸鹼度變化。屬 NGS 技術，以電子感測方式讀取訊號。 奈米孔定序nanopore sequencing核酸通過奈米孔時造成離子電流變化，據此推定序列。屬單分子定序，可納入廣義新世代定序。 單分子定序single molecule sequencing直接偵測個別核酸分子的序列資訊。可由許多分子平行讀取達到高通量；單分子不等於低通量。 四、ARMS：以選擇性增幅偵測已知突變 增幅阻礙突變系統（amplification refractory mutation system，ARMS）屬於等位基因專一性 PCR。其關鍵是引子，尤其是引子 3′ 端與目標序列的配對情形；利用不同等位基因的增幅差異，判斷是否具有特定突變。 ARMS 通常依預先設定的突變位點設計引子，再判讀是否出現相應增幅訊號。它本身不逐一讀出核苷酸排列順序，因此不是 NGS 的讀序技術。判斷時應區分「偵測特定突變」與「取得 DNA 序列」，兩者不能畫上等號。 五、Phred 品質分數：分數越高，錯誤機率越低 Phred 品質分數表示單一鹼基判讀的估計錯誤機率，公式為 Q = −10 × log10(p)，其中 p 是錯誤機率。反推可得 p = 10 的（−Q/10）次方。 當 Q = 30，指數為 −30/10 = −3，因此 p = 0.001 = 0.1%，也就是千分之一的估計錯誤機率；相應的正確率為 1 − p = 99.9%。 品質分數錯誤機率 p錯誤率正確率 Q200.011%99% Q300.0010.1%99.9% Q400.00010.01%99.99% Q 值每增加 10，錯誤機率降為原來的十分之一。這是對數尺度，不能把 Q 值直接當作錯誤百分比。Q30 也不表示每讀取一千個鹼基就必定錯一個，而是描述鹼基判讀的估計錯誤機率。 常考陷阱 「Sanger 自動化，所以屬於 NGS」：自動化與大量平行定序是不同概念。Sanger 仍歸為第一代定序。 「奈米孔常稱第三代，所以必須排除於廣義 NGS」：須注意分類語境；廣義新世代定序可包括奈米孔與單分子技術。 「單分子代表低通量」：單分子描述偵測單位；同時讀取許多單分子，仍可達到高通量。 「ARMS 能找突變，所以是定序方法」：ARMS 依專一性增幅判斷特定突變，並不直接讀出序列。 「ddNTP 比 dNTP 少的是 2′-OH」：dNTP 本來就缺少 2′-OH；兩者的關鍵差異是 ddNTP 再缺少 3′-OH。 「引子或聚合酶造成鏈終止」：引子提供起點，聚合酶催化延長；造成 Sanger 鏈終止的是接入的 ddNTP。 「Q30 等於錯誤率 0.03 或 0.003」：應先算 −30/10 = −3，得到 0.001；換成百分比才是 0.1%，不要混淆小數與百分比。 記憶口訣 「二去氧、三停鏈」：一般去氧核糖缺 2′-OH；再缺 3′-OH 就無法延長。 「焦磷看光、半導看氫、奈米看電流」：記住各定序技術的訊號來源。 「ARMS 看增幅，Sanger 靠終止」：區分突變專一性檢測與鏈終止定序。 「Q 加十，錯少十倍；Q 三十，錯千分一」：快速掌握品質分數換算。