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學習重點 辨認模板與產物：反轉錄酶以 RNA 為模板合成 DNA，是以 mRNA 製備 cDNA 的關鍵酵素。 掌握反轉錄酶的活性：典型反轉錄酶具有 RNA 依賴性 DNA 聚合酶、DNA 依賴性 DNA 聚合酶及 RNase H 活性，不具有 RNA 依賴性 RNA 聚合酶活性。 區分切割、連接與末端修飾：限制酶屬於核酸內切酶；DNA 連接酶可封合 DNA 單股切口；多核苷酸激酶負責末端磷酸化。 掌握回文判讀與 WGS 限制：回文須比較反向互補序列；WGS 的臨床限制主要包括資料分析、變異解讀及足夠定序深度所需的成本。 核心觀念 一、反轉錄酶：RNA 為模板，DNA 為產物 反轉錄酶（reverse transcriptase）是一種RNA 依賴性 DNA 聚合酶（RNA-dependent DNA polymerase）。「依賴性」指出模板種類，「聚合酶」前的核酸名稱指出產物種類。因此，RNA-dependent DNA polymerase 就是以 RNA 為模板合成 DNA 的酵素。 以 mRNA 合成互補 DNA（complementary DNA，cDNA）時，需使用反轉錄酶。反應需要模板、引子及去氧核苷三磷酸（dNTP），由引子的 3′ 端延長，DNA 合成方向為 5′→3′。常用引子包括 oligo-dT、隨機引子及基因專一性引子；oligo-dT 可與具有 poly-A 尾的 mRNA 配對。 活性名稱模板或作用對象功能與判斷 RNA-directed DNA polymeraseRNA合成 DNA，為反轉錄酶的核心功能。 DNA-directed DNA polymeraseDNA合成 DNA，屬於典型反轉錄酶可具有的活性。 RNase HRNA-DNA 雜合雙股中的 RNA 股降解 RNA 股，協助移除 RNA 模板。 RNA-directed RNA polymeraseRNA合成 RNA，不屬於反轉錄酶的典型活性。 國考辨認反轉錄酶時，應掌握上述典型活性組合；實驗用的工程化酵素則可能降低或去除 RNase H 活性。RNase H 是分解 RNA 的活性，不是合成 RNA 的活性。 一般 RNA 聚合酶是以 DNA 為模板合成 RNA，負責轉錄；T7 DNA 聚合酶與一般 PCR 使用的 Taq DNA 聚合酶主要以 DNA 為模板，不能直接取代反轉錄酶完成 mRNA 到 cDNA 的步驟。拓樸異構酶則調整 DNA 的拓樸狀態，並非製備 cDNA 的酵素。 二、限制酶：在 DNA 內部切割的核酸內切酶 限制酶（restriction enzyme）屬於核酸內切酶（endonuclease），會切斷 DNA 鏈內部的磷酸二酯鍵。核酸外切酶（exonuclease）則從核酸末端移除核苷酸；兩者的分類關鍵在於切割位置。 典型 Type II 限制酶辨識特定的雙股 DNA 短序列，並在辨識序列內或附近切割。許多常見 Type II 限制酶辨識回文序列，但並非所有亞型都如此，因此不能把回文辨識說成所有限制酶的絕對特性。 三、回文序列：比較兩股各自的 5′→3′ 方向 DNA 回文是指雙股 DNA 的兩股各自由 5′ 端讀向 3′ 端時，序列相同。若只給一股序列，應先取互補，再反轉方向；所得的反向互補序列若與原序列相同，即符合此回文特徵。 例如： 5′-GTCGAC-3′3′-CAGCTG-5′ 上股由左向右讀是 GTCGAC；下股由右向左、依 5′→3′ 方向讀，也得到 GTCGAC，因此符合典型回文辨識序列。 原序列，均以 5′→3′ 表示反向互補序列，均以 5′→3′ 表示是否相同 GTCGACGTCGAC相同，符合回文特徵。 GAAGCTTC不同。 GAGCTC不同。 GTAATGCATTAC不同。 單股文字左右對稱不等於 DNA 回文。例如 GAG 倒過來仍是 GAG，但其反向互補序列為 CTC，並不符合雙股 DNA 的回文定義。 四、DNA 連接酶與末端修飾酵素 雙股 DNA 若只有其中一股的一個磷酸二酯鍵斷裂，而沒有遺失核苷酸，稱為單股切口（nick）。在相鄰兩端具備適當的 3′-OH 與 5′-磷酸基時，DNA 連接酶（DNA ligase）可催化形成磷酸二酯鍵，直接封合切口。依酵素來源不同，反應可利用 ATP 或 NAD 作為輔助因子。 須區分切口與缺口：切口只有鍵斷裂；缺口（gap）則有核苷酸缺失，通常須先由 DNA 聚合酶補入核苷酸，再由連接酶封口。 酵素主要功能能否直接封合 DNA 切口 DNA 連接酶連接相鄰的 3′-OH 與 5′-磷酸基，形成磷酸二酯鍵。可以。 核酸外切酶 III具有由 3′ 端移除 DNA 核苷酸等活性。不可以。 多核苷酸激酶將磷酸基轉移至核酸的 5′-OH 端，可用於末端磷酸化。不可以；準備末端不等於完成連接。 多核苷酸磷酸化酶主要參與 RNA 的磷酸解，也可在適當條件下催化逆向聚合。不可以；不是 DNA 連接酶。 五、全基因體定序的癌症臨床應用限制 全基因體定序（whole-genome sequencing，WGS）涵蓋廣泛的基因體區域，但取得大量序列不等於每個變異都有臨床用途。評估癌症檢驗的應用限制時，應掌握以下三點： 資料分析繁瑣：龐大資料須經品質控管、序列比對、變異偵測及註解，分析與判讀需要時間及專業人力。 變異的臨床意義有限：許多變異尚無法確定與病情的關係，也未必能據以選擇有效治療。 足夠定序深度增加成本：定序深度指某位置被讀取覆蓋的次數。癌症檢體可能混有正常細胞或不同腫瘤亞群，低比例變異需要足夠深度才能可靠偵測；全基因體皆達到所需深度，會增加定序與分析負擔。 「儀器至少需要兩週才能完成定序反應」不是 WGS 的必然特性。定序反應時間取決於平台與流程，不能一概設定至少兩週。也須區分儀器定序反應時間與整體報告時間；後者還包括檢體處理、資料分析、判讀及確認。 常考陷阱 看到 RNA 模板，就認為產物也是 RNA：先分辨模板與產物；反轉錄的方向是 RNA→DNA。 把 RNase H 當成 RNA 聚合酶：RNase H 降解 RNA-DNA 雜合分子中的 RNA 股，不負責合成 RNA。 否認反轉錄酶的 DNA-directed DNA polymerase 活性：典型活性組合包括兩種 DNA 聚合活性及 RNase H；應排除的是 RNA-directed RNA polymerase。 把限制酶歸為外切酶：限制酶在 DNA 內部切割；外切酶從末端移除核苷酸。 把末端磷酸化等同於連接：多核苷酸激酶可處理 5′ 端，但直接封合磷酸二酯鍵的是 DNA 連接酶。 只將序列倒讀就判定回文：必須取反向互補，並統一以 5′→3′ 比較。 把 WGS 報告耗時等同於儀器反應耗時：資料分析、臨床解讀與成本是實際限制；「定序反應必須至少兩週」不能視為普遍成立的理由。 記憶口訣 「反轉 RNA 成 DNA；限制內切，連接封口，激酶加磷。」 「回文先互補，再反向；兩股五到三，相同才算。」 「全基因體三關卡：資料多、解讀難、深度花錢。」