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學習重點 己糖激酶法的反應鏈：葡萄糖先經己糖激酶形成葡萄糖-6-磷酸（G6P）及 ADP，再由 G6PD 偶合反應產生 NADPH，以 340 nm 吸光度增加量定量。 專一性的主要來源：己糖激酶可作用於其他己糖，整套方法的高度專一性主要來自第二段的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PD）。 參考法與方法比較：本單元所指 IFCC 血漿葡萄糖定量參考法為己糖激酶法；比較專一性時，須辨認選項中是否有己糖激酶／G6PD 組合。 區分氧化酶與去氫酶：葡萄糖氧化酶法可搭配過氧化酶呈色或電極偵測；以 NAD 為輔酶的葡萄糖去氫酶法可測量 340 nm 吸光度，不需過氧化酶。 掌握干擾與精密度：尿素通常不干擾己糖激酶法；膽紅素、脂血及溶血可能干擾。CV 越低代表精密度越好，本單元將己糖激酶法與葡萄糖氧化酶法均列為低 CV 的可接受答案。 核心觀念 一、己糖激酶法：兩段反應與定量訊號 己糖激酶法（hexokinase method）利用兩段酵素反應，將葡萄糖濃度轉換為可測量的 NADPH 訊號。第一段由己糖激酶催化，通常需要鎂離子參與： 葡萄糖＋ATP → 葡萄糖-6-磷酸（G6P）＋ADP 此步驟是磷酸化反應，消耗 ATP 並生成 ADP。因此，問到「哪一種酵素反應會生成 ADP」，應辨認己糖激酶。 第二段由葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PD，亦寫作 G6PDH）催化。G6P 被氧化，先形成內酯中間產物，再水解為 6-磷酸葡萄糖酸；教學上可將總反應簡記為： G6P＋NADP+＋水 → 6-磷酸葡萄糖酸＋NADPH＋H+ NADPH 在 340 nm 有明顯吸收，因此最後量測的是340 nm 吸光度增加。在反應完全且條件適當時，NADPH 的生成量與原有葡萄糖量成正比。 必須分清三種角色：己糖激酶是起始酵素，G6PD 是偶合酵素，NADPH 是最後的定量指標。若以 G6PD 為描述起點，仍須先加入己糖激酶，將葡萄糖轉成 G6PD 能利用的 G6P。 二、己糖激酶法的專一性與參考法地位 己糖激酶本身並非只辨識葡萄糖，也能催化其他己糖的磷酸化。整套方法之所以具有高度專一性，主要在於 G6PD 對 G6P 的受質選擇性，不能把專一性主要歸因於己糖激酶。 當己糖激酶／G6PD、葡萄糖氧化酶／過氧化酶、鄰甲苯胺及鹼性鐵氰化物法並列時，專一性最高選己糖激酶／G6PD 法。若選項沒有此組合，而列出葡萄糖去氫酶法、葡萄糖氧化酶法、縮合法及鹼性鐵氰化物法，本單元的判定為葡萄糖去氫酶法。 本單元所稱定量血漿葡萄糖的IFCC 參考方法為己糖激酶法。葡萄糖氧化酶法雖可用於例行檢驗與電極測定，仍不能因此認定為此處所指的參考法。 三、各種血糖測定法比較 方法反應與偵測重點辨識關鍵 己糖激酶／G6PD 法先形成 G6P、ADP，再形成 6-磷酸葡萄糖酸與 NADPH；測量 340 nm 吸光度增加。需偶合 G6PD；高度專一；本單元的參考法。 葡萄糖氧化酶法利用氧氧化葡萄糖，形成葡萄糖酸內酯與過氧化氫；內酯可水解成葡萄糖酸。可用過氧化酶呈色，也可用電極測量氧消耗或過氧化氫生成。 葡萄糖去氫酶法直接氧化葡萄糖；以 NAD 為輔酶者產生 NADH，可測量 340 nm 吸光度增加。不需先形成 G6P，也不需過氧化酶。 Benedict 法、Folin-Wu 法利用還原物質還原銅離子；Benedict 法可形成氧化亞銅沉澱。可與多種還原糖或其他還原物質反應，並非葡萄糖專一法。 鹼性鐵氰化物法利用還原性，使鐵氰化物被還原。易受其他還原物質影響，專一性較低。 鄰甲苯胺法（o-toluidine）利用糖的醛基與試劑縮合呈色。屬化學縮合法，專一性不及己糖激酶／G6PD 法。 葡萄糖去氫酶與 G6PD 是不同酵素：前者直接以葡萄糖為受質；後者以 G6P 為受質。也不能單憑「340 nm 吸光度增加」就認定為己糖激酶法，還須搭配 NADPH、G6PD 或 6-磷酸葡萄糖酸等線索。 葡萄糖去氫酶有不同輔酶型式；本單元涉及 340 nm 的敘述，是指可生成 NADH 等還原型輔酶的測定系統，不宜擴大為所有葡萄糖去氫酶試劑皆以此方式偵測。 四、葡萄糖氧化酶、過氧化酶與 mutarotase 葡萄糖氧化酶主要作用於β 型葡萄糖。Mutarotase（變旋酶）可加速 α、β 型葡萄糖相互轉換，讓可供反應的 β 型更快補充，因而縮短反應時間；它本身不負責產生最後的呈色訊號。 呈色法利用葡萄糖氧化酶產生的過氧化氫，再由過氧化酶催化色原反應。電極法則可測量氧的消耗或過氧化氫的生成，因此「葡萄糖氧化酶法可用電極偵測」是正確觀念。 維生素 C 等還原物質可能消耗過氧化氫或抑制呈色，使葡萄糖氧化酶／過氧化酶呈色法產生負向干擾。干擾程度與方向仍須配合實際試劑及偵測設計判斷。 五、干擾、專一性與精密度的判讀 己糖激酶法：尿素通常不造成分析干擾；膽紅素、三酸甘油脂增加所造成的脂血，以及溶血，則可能影響反應或光學讀值。不能宣稱溶血完全不干擾，也不能將干擾方向一律固定。 葡萄糖去氫酶法：本單元傳統酵素法的比較中，可接受其特異性與葡萄糖氧化酶相近、常用抗凝固劑通常不干擾的敘述；實際仍須依試劑規格判斷，不能推論所有酵素來源及抗凝固劑都相同。 CV 與精密度：CV＝標準差÷平均值×100%。在可比較條件下，CV 越低，表示重複測量越集中、精密度越好，並不直接代表專一性或準確度最高。 低 CV 的方法：本單元將己糖激酶法與葡萄糖氧化酶法均列為可接受答案；不宜背成己糖激酶法在所有儀器、濃度與試劑條件下必定具有唯一最低 CV。Mutarotase 是加速變旋的輔助酵素，不是獨立的血糖定量法。 常考陷阱 「專一性主要來自己糖激酶」：錯在忽略己糖激酶也能作用於其他己糖；主要關鍵是偶合酵素 G6PD。 「己糖激酶直接生成 NADPH」：己糖激酶直接生成 G6P 與 ADP；NADPH 由後續 G6PD 反應產生。 「340 nm 吸光度減少」：此處生成 NADPH，吸光度應增加。 「己糖激酶法產生葡萄糖酸、需要過氧化酶」：己糖激酶／G6PD 法的產物包含 6-磷酸葡萄糖酸，且不需過氧化酶；過氧化酶是葡萄糖氧化酶呈色系統的搭配酵素。 「葡萄糖去氫酶法需加入過氧化酶」：不需要；其反應與過氧化氫呈色系統不同。 「葡萄糖氧化酶法就是 IFCC 參考法」：本單元應辨認己糖激酶法。 「尿素、溶血都不干擾己糖激酶法」：尿素通常不干擾，但溶血可能干擾，兩者不可混為一談。 「還原糖陽性等於葡萄糖專一陽性」：Benedict 等化學還原法可偵測其他還原糖，專一性不足。 記憶口訣 「己糖先磷酸，ATP 變 ADP；六磷再脫氫，NADPH 升；三四零往上，專一靠 G6PD。」 「氧化可電極，呈色接過氧；變旋催轉型，維 C 可壓色。」