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學習重點 掌握電泳的基本原理：帶電分子在電場中移動，分離結果受電荷、質量、形狀、緩衝液與電場條件影響。 區分電泳移動與電滲流，了解毛細管區帶電泳可利用電滲流輸送待測物。 熟記等電點聚焦利用兩性電解質載體建立 pH 梯度，並依 pH 與 pI 判斷蛋白質移動方向。 辨認免疫固定電泳的抗原－抗體反應，以及基本電泳裝置與後續定量儀器的差別。 核心觀念 一、電泳分離原理與影響因素 電泳是帶電粒子在電場作用下，相對於周圍液體產生移動的現象。帶正電者往負極（陰極），帶負電者往正極（陽極）。移動速度取決於電場強度及電泳移動度；移動度則與分子的淨電荷、大小、形狀及介質阻力有關。 以瓊脂糖凝膠分析血清蛋白，主要依據蛋白質的電荷與質量差異分離。血清蛋白使用的瓊脂糖凝膠孔隙較大，分子篩效應通常較小，電荷差異尤其重要；不能將其分離原理簡化為只看分子大小，也不是依氫鍵數量、四級結構或與介質的親和力分離。 緩衝液 pH：影響蛋白質的淨電荷，因而改變移動方向與速度。 緩衝液離子強度：影響導電性、電荷屏蔽與發熱情形，會改變分離結果。 電壓與電流：影響移動與發熱。散熱不足時，焦耳熱可能造成區帶擴散、變形或蛋白質變性。 支持介質：其孔隙、固定電荷及吸附作用均可能影響分離。 樣本吸管頭材質：在一般正常操作條件下，不屬於決定電泳分離結果的主要因素。 二、支持介質與電滲流 電滲流或內滲透（electroendosmosis、endosmosis）是液體在電場作用下，相對於固定介質整體移動的現象。介質表面帶有固定電荷時，附近會聚集反離子；可移動的反離子受電場驅動，帶動液體流動。它與「待測分子本身帶電而移動」的電泳不同。 在其他條件相近、羧基可解離的情況下，膠體含有越多羧酸基（carboxylic acid groups），越容易產生負固定電荷並造成內滲透。負電表面附近的可移動陽離子通常帶動液體往負極流動。 支持介質電滲流特性與考點 乙酸纖維素可有內滲透，液體流動可能影響蛋白質表觀位置。 瓊脂糖可有電滲流，程度與介質中的帶電基團等條件有關。 聚丙烯醯胺膠固定電荷較少，所列介質中較不易出現內滲透。 玻璃毛細管內壁矽醇基解離後可帶負電，常形成明顯電滲流。 血清蛋白在常用鹼性緩衝液中多帶負電，電泳方向朝正極；若液體電滲流朝負極，便與蛋白質的電泳方向相反。γ 球蛋白本身移動較慢，較容易受到此流動影響，甚至呈現向負極的表觀位移。不可說內滲透使 γ 球蛋白向正極移動，也不能用它解釋 β 球蛋白必然分成兩條帶。 界達電位（zeta potential）是介面附近滑動面相對於溶液主體的電位差，與表面及溶液條件有關；不能概括成「溶液中的 zeta potential 大部分帶負電」。 三、毛細管區帶電泳 毛細管區帶電泳利用待測物電泳移動度的差異分離，電滲流則參與整體輸送。在常見的未塗覆熔融矽毛細管、內壁帶負電且採一般極性操作的條件下，電滲流朝負極。 待測物的表觀速度是本身電泳速度與電滲流速度的向量和。陽離子的電泳方向可與電滲流同向；陰離子的電泳方向則相反，若電滲流較強，陰離子仍可能被帶往負極。 中性分子也能隨電滲流移動，但在一般毛細管區帶電泳中，中性分子缺乏電泳移動度差異，不能僅靠電滲流彼此分離。因此，「可被輸送」不等於「可互相分離」。 毛細管內徑小、散熱效率佳，可使用高電場。在毛細管、等電點聚焦、脈衝場及一般變性電泳的典型比較中，毛細管電泳所需電壓最高。脈衝場電泳的特色是週期性改變電場方向，不代表電壓最高。 四、等電點聚焦電泳 等電點聚焦（isoelectric focusing，IEF）利用酸鹼度梯度，依蛋白質的等電點（pI）分離。傳統載體型 IEF 使用兩性電解質載體（carrier ampholytes）建立 pH 梯度；聚丙烯醯胺與瓊脂糖可提供支持架構，但不是此梯度的主要來源。 局部 pH 與 pI 的關係蛋白質淨電荷電泳方向 pH＜pI正電往負極 pH＝pI約為零停止淨電泳移動並聚焦 pH＞pI負電往正極 例如 pI＝8 的蛋白質位於 pH＝4 處，因 pH 低於 pI 而帶正電，會往負極移動，到局部 pH 接近 8 時聚焦。蛋白質若擴散離開等電點位置，便重新帶電並移回，因此能形成狹窄區帶。 IEF 的關鍵不是溫度、密度、鹽度或離子強度梯度。SDS 是陰離子去垢劑，用於 SDS-PAGE 時可使蛋白質變性並形成近似一致的電荷質量比，使分離主要反映分子大小；SDS 不是建立 IEF pH 梯度的材料。一般未變性的聚丙烯醯胺膠電泳則仍受電荷、大小與形狀共同影響。 五、免疫固定電泳與基本裝置 免疫固定電泳（immunofixation electrophoresis）先將蛋白質電泳分離，再加入特異性抗血清，使相應抗原與抗體形成沉澱，洗去未結合成分後染色觀察。其辨識關鍵是抗原與抗體的特異性反應，可用於辨認單株免疫球蛋白的類型。 基本電泳分離裝置包含電源、電泳槽與電極、支持介質及緩衝液。轉換器（transducer）不屬於此基本組成；光密度掃描器（densitometer）用於分離後掃描區帶及定量，也不屬於完成電泳分離所必需的基本裝置。 常考陷阱 「聚丙烯醯胺或瓊脂糖形成 IEF 的 pH 梯度」：應選兩性電解質載體；支持骨架與梯度來源須分清楚。 「pH 低於 pI，蛋白質往正極」：此時帶正電，應往負極；只有到達 pH＝pI 才停止淨電泳移動。 「所有介質都沒有內滲透」：聚丙烯醯胺膠只是相對較少；玻璃毛細管則可利用明顯電滲流。 「電滲流就是帶電蛋白的移動」：電滲流是液體整體流動，與蛋白質本身的電泳方向可能相反。 「毛細管區帶電泳可單靠電滲流分開中性分子」：中性分子可隨流移動，但一般無法藉此彼此分離。 「掃描器是基本電泳分離裝置」：它負責後續讀取與定量，應與電源、介質及緩衝液區分。 「等電點聚焦利用抗原－抗體反應」：IEF 看 pI；免疫固定才看抗原－抗體特異性。 記憶口訣 「低於等電帶正走負，高於等電帶負走正；兩性建梯度，等電就聚焦；聚膠少內滲，毛管用高壓；免疫固定認抗體。」