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學習重點 掌握 PCR 的流程與必要組成：依序為變性、引子黏合、延伸；需要耐熱 DNA 聚合酶，不需要 DNA 連接酶。 熟悉指數擴增：理想情況每循環倍增，增加 n 個循環，產物量即為原來的 2 的 n 次方倍。 判讀黏合溫度與電泳結果：溫度過低易有雜帶，過高則擴增不足；最佳條件須兼顧正確產物量與專一性。 區分 RT-PCR、即時定量 PCR 與數位 PCR：分別掌握反轉錄、逐循環螢光監測，以及分割反應後的絕對定量。 核心觀念 一、PCR 的基本流程與必要條件 聚合酶鏈鎖反應（PCR）利用引子界定欲擴增的 DNA 區域，經反覆循環大量複製特定片段。三個主要步驟的順序為變性 → 引子黏合 → 延伸。 變性（denaturation）：以高溫使雙股 DNA 分開，形成可供複製的單股模板。 引子黏合（primer annealing）：降低溫度，使正向與反向引子分別與互補的模板序列配對。 延伸（extension）：DNA 聚合酶從引子的 3′端加入核苷酸，以 5′→3′方向合成新股。 PCR 的必要組成包括模板 DNA、兩條寡核苷酸引子、四種去氧核糖核苷三磷酸（dNTP）、耐熱 DNA 聚合酶，以及含適當鎂離子與鹽類的緩衝液。dNTP 是合成 DNA 的原料，引子提供聚合酶開始延伸所需的 3′端。 一般 PCR 使用 Taq 等耐熱性 DNA 聚合酶，以承受反覆高溫變性。DNA 連接酶主要負責連接 DNA 片段，不是一般 PCR 的必要成分。 二、指數擴增與循環數計算 在每循環擴增效率皆為 100% 的理想條件下，目標 DNA 每循環增加為原來的兩倍。若起始量為 N，經 n 個循環後，理論量為N × 2 的 n 次方。 比較不同循環數時，只需計算循環數的差：相差 k 個循環，理論產物量相差 2 的 k 次方倍。因此，多做三個循環為 2 × 2 × 2＝8 倍；30 個循環的理論擴增倍率為 2 的 30 次方，不能算成 2 × 30。 實際 PCR 會受擴增效率、試劑消耗與反應抑制等因素影響，後期可進入平台期，因此上述倍增關係是理想推算，不能直接套用於所有終點產物的比較。 三、黏合溫度與條件最佳化 黏合溫度影響引子配對的專一性。梯度 PCR 可在其他條件相同時，測試不同黏合溫度，再以電泳比較產物大小、產量與雜帶情形。 黏合溫度主要影響電泳表現 過低引子較容易與非目標序列配對雜帶較多，可能出現拖尾或塗抹狀訊號（smearing） 適當兼顧專一性與擴增效率預期大小的條帶清楚，雜帶少 過高引子不易有效黏合目標條帶變弱，甚至無明顯產物 梯度電泳若依序呈現雜帶較多 → 預期大小的單一條帶清楚 → 條帶變弱或消失，符合黏合溫度由低至高的典型變化。判讀時須先找出預期產物大小，再比較專一性；不能只選整個泳道最亮的條件。 出現許多雜帶或 smearing 時，在黏合溫度相關的調整選項中，應優先考慮提高黏合溫度。降低溫度、增加引子或增加 Taq 用量，可能加重非專一性擴增。實際上 smearing 也可能涉及模板品質、用量及其他反應條件，不能認定只有單一原因。 四、RT-PCR：先將 RNA 轉為 cDNA 反轉錄 PCR（RT-PCR）先利用反轉錄酶，以 RNA 為模板合成互補 DNA（cDNA），再以 cDNA 進行 PCR 擴增。因此，辨識關鍵是RNA → cDNA → PCR。 RT 指 reverse transcription，不能直接等同 real-time。一般終點 RT-PCR 可用於檢測 RNA 是否存在；若要定量 RNA 表現量，可結合即時定量 PCR，稱為 RT-qPCR。RFLP 是限制片段長度多型性分析，原位雜交則在細胞或組織中偵測核酸序列，皆不同於此流程。 五、即時定量 PCR：以螢光監測擴增 即時定量 PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）使用螢光染劑或螢光標記探針，在擴增過程中逐循環偵測訊號，據以推估起始標靶量，不必跑膠即可定量，也不是只檢測最後的 DNA 終產物。 Ct 或 Cq 是螢光訊號達到設定門檻所需的循環數。在相同檢測條件與相近擴增效率下，起始標靶越多，Ct／Cq 通常越低。 絕對定量：通常以已知濃度或拷貝數的標準品建立標準曲線，換算未知樣本的標靶量。 相對定量：通常以參考基因校正，再與校正樣本或對照組比較，得到相對表現量；可使用 Ct 差值法，不一定需要標準曲線。 qPCR 定量的是特定標靶序列，不能概括說成可準確測出樣本中所有 DNA 的總量。 熔解曲線分析常用於染劑型 qPCR 擴增後，協助判斷產物專一性與引子二聚體；它不是開始即時監測前必須完成的步驟，也不是所有 qPCR 都必須執行。Tm 為雙股核酸的熔解溫度，受序列、GC 含量與溶液條件等影響，不能視為與待測 DNA 濃度成正比的定量指標。 六、數位 PCR：分割、判讀與絕對定量 數位 PCR（digital PCR，dPCR）將樣本分成大量獨立微反應單元，在各單元內進行 PCR，完成後依螢光訊號判定為陽性或陰性，形成二進位判讀。 分割單元可能含零個、一個或多個標靶分子，並非保證每格恰有一個分子。因此，需利用陽性、陰性單元比例及Poisson（卜瓦松）統計修正估算標靶數量，再配合分割體積與稀釋資訊換算濃度或拷貝數。 比較項目即時定量 PCR數位 PCR 主要偵測方式逐循環監測螢光，以 Ct／Cq 分析擴增後計算陽性與陰性分割單元 定量原理標準曲線定量，或與參考及校正樣本比較分割計數配合統計修正 絕對定量通常需要標準曲線不需標準曲線，也不需靠對照組的相對比較 dPCR 適合低拷貝數標靶與稀少變異的偵測；實際靈敏度仍受投入分子數、樣本品質與反應設計影響。「不需對照組作相對定量」不代表不必設置品質控制，仍應有適當的陰性、陽性對照。 常考陷阱 「DNA 連接酶是 PCR 必需酵素」：錯；一般 PCR 依靠耐熱 DNA 聚合酶延伸新股。 「增加三個循環就是三倍」：錯；理想倍率為 2 的三次方，即八倍。 「雜帶多應降低黏合溫度」：錯；通常應提高溫度以改善專一性。 「即時 PCR 不可使用螢光，只看最終產物」：錯；其核心正是逐循環螢光監測。 「定量前必須先做熔解曲線，Tm 越高表示濃度越高」：錯；熔解曲線主要協助確認專一性，定量應看 Ct／Cq 等資訊。 「數位 PCR 的二進位分析屬於相對定量」：錯；陽性、陰性判讀配合統計修正，可進行無標準曲線的絕對定量。 「RT-PCR 就是即時定量 PCR」：錯；RT 強調反轉錄，real-time 強調即時偵測，兩者可以結合。 記憶口訣 先變、再黏、後延伸；循環多三，產物乘八。低溫易雜帶，高溫易少帶；即時看曲線，數位數單元。RT 先轉錄，Ct 低則起始多；數位分格算，絕對免曲線。