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學習重點 掌握流式細胞儀兩種基本光散射訊號：前向散射（FSC，小角度）反映細胞大小（體積），側向散射（SSC，約 90 度）反映細胞內部複雜度與顆粒性。 能依正常白血球的大小與顆粒性判讀散射圖：顆粒球 SSC 最高，成熟淋巴球 SSC 最低、FSC 也小；嗜酸性球 SSC 高於單核球。 熟記 488 nm 雷射可同時激發 FITC 與 PE，FITC 發射波峰約 520 nm（綠），PE 約 575 nm（橘黃），兩者發射光譜會重疊。 理解發射光譜重疊造成螢光溢出（spillover），適當濾鏡可降低干擾，再以螢光補償扣除殘餘溢出；螢光色數愈多，補償愈重要。 了解自動血球分析儀結合散射與核酸螢光染色的應用及限制：不能完全取代抹片、WBC 與網狀紅血球分屬不同管路、血小板也能以核酸螢光計數。 核心觀念 一、光散射訊號的基本原理 流式細胞儀使細胞在鞘流中逐一通過雷射光束，偵測器在不同角度收集散射光。自動血球分析儀的題目常寫成「小角度折射（forward scatter）」與「90 度角折射（side scatter）」，意義相同。 訊號偵測角度代表特性判讀重點 前向散射（FSC／FS）與入射光同方向的小角度細胞大小（size）訊號強度正比於細胞體積，細胞愈大 FSC 愈高 側向散射（SSC／SS）約 90 度細胞內部複雜度、顆粒性（granularity）胞內顆粒、胞器、核分葉愈多，SSC 愈高 散射訊號不代表細胞成熟度，也不代表存活狀態。成熟度與分化來源要靠 CD 抗原等免疫表型判定；存活率則以 7-AAD、PI 等可進入死細胞的染劑評估。 二、各類白血球的散射特性 細胞FSC（大小）SSC（顆粒性） 顆粒球（嗜中性球、嗜酸性球）中至大最高；嗜酸性球粗大顆粒，SSC 甚至略高於嗜中性球 單核球最大中等，低於顆粒球 成熟淋巴球小最低 芽細胞（blasts）小至中低（顆粒少），常落在淋巴球與單核球之間的區域 比較 SSC 時，只要選項中有顆粒球（含分節中性球、嗜酸性球，以及已具次級顆粒的髓細胞 myelocyte），它們都高於成熟淋巴球；因此「SSC 最小」選成熟淋巴球，「SSC 最高」選顆粒球。比較 FSC 時，成熟淋巴球體積小於顆粒球，所以其 FSC 低於顆粒球。 三、自動血球分析儀的光學與螢光應用 白血球分類：以 FSC、SSC 搭配核酸螢光染色，可分類白血球並提示異常細胞（如芽細胞、異型淋巴球），但僅是篩檢；有旗標或疑似異常時仍須人工血液抹片確認，故無法完全取代抹片。 網狀紅血球計數：網狀紅血球含殘餘 RNA，可用核酸螢光染劑計數。但 WBC 計數與網狀紅血球計數使用不同試劑與處理（WBC 管路需溶解紅血球，網狀紅血球管路須保留紅血球），屬不同管路／通道分析，不是同一管路同時完成。 血小板計數：血小板雖無細胞核，但仍含 RNA（年輕血小板更多），可以用核酸螢光染色計數，並可推算未成熟血小板分率（IPF）。「無核就沒有核酸訊號、無法螢光計數」是錯誤推論。 四、常用螢光染劑的激發與發射 螢光染劑激發光源發射波峰顏色 FITC（fluorescein）488 nm 藍光雷射約 517～520 nm綠色 PE（phycoerythrin）488 nm 藍光雷射（亦可被其他波長激發）約 575 nm橘黃色 單一 488 nm 光源即可同時激發 FITC 與 PE，再以不同濾鏡分別收集兩者的發射光，這是雙色免疫分型的基礎。注意「激發波長」是吸收的光，「發射波長」是釋出的螢光；FITC 對應約 520 nm，PE 對應約 575 nm，不可對調。兩者的發射光譜有重疊：FITC 發射光譜的長波長尾端會延伸進 PE 偵測範圍，PE 也有少部分落入 FITC 通道。 五、螢光補償（color compensation） 多色分析時，某染劑的螢光漏進其他偵測通道稱為溢出（spillover），例如 FITC 訊號被 PE 偵測器收到，使 PE 被高估。處理方式有兩層： 光學濾鏡：以帶通濾鏡只收集各染劑發射峰附近的窄波段，可降低光譜重疊造成的訊號干擾。 螢光補償：以單染對照計算各通道間的溢出比例，再從訊號中扣除，還原真實的螢光強度。濾鏡無法完全消除重疊，因此仍需補償。 補償的對象是不同染劑之間的發射光譜重疊：只要發射光譜重疊就必須補償，不會因「光譜重疊」反而不需補償。同時使用的螢光愈多，彼此重疊愈多，補償的影響愈顯著。補償不是用來校正檢體本身的自發螢光（autofluorescence），自發螢光以未染色對照或同型對照評估背景。 常考陷阱 FSC 與 SSC 對調：「FSC 反映複雜度」「SSC 反映細胞尺寸」皆錯。前向看大小，側向看顆粒。 散射代表成熟度或存活率：FSC、SSC 都只反映大小與顆粒性；成熟度看免疫表型，存活率看 7-AAD／PI 等染劑。 淋巴球與顆粒球比較顛倒：成熟淋巴球體積小、顆粒少，FSC 與 SSC 都低於顆粒球；「淋巴球 FSC 比顆粒球高」錯誤。 嗜酸性球與單核球比較：單核球雖較大，但 SSC 看顆粒性，嗜酸性球粗大顆粒使 SSC 較高，此敘述正確。 「完全取代人工抹片」：只要出現「完全取代」即錯，儀器只能篩檢與提示。 「同一管路同時計算 WBC 與網狀紅血球」：錯誤，兩者處理方式不同，分屬不同管路。 「血小板無核所以無法以核酸螢光計數」：錯誤，血小板含 RNA，可被核酸螢光染劑標記計數。 FITC 與 PE 波峰互換：FITC 約 520 nm、PE 約 575 nm；選項寫「FITC 約 574 nm」「PE 約 517 nm」皆錯。 「FITC 與 PE 光譜不會重疊」：錯誤，正因為會重疊才需要濾鏡與補償。 「補償用於調校自發螢光」：錯誤，補償處理的是染劑間的溢出。 「光譜重疊則不需補償」：邏輯顛倒，有重疊才需要補償。 「螢光愈多，補償影響愈不顯著」：相反，色數愈多，補償愈重要。 濾鏡的作用：「使用適當濾鏡可降低光譜重疊干擾」是正確敘述。 記憶口訣 「前看大小，側看顆粒；顆粒球最亮，淋巴最暗；酸球顆粒粗，側向勝單核。」 「一道藍光 488，綠 FITC 520，橘 PE 575；濾鏡減重疊，補償扣溢出，顏色愈多補愈重。」