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學習重點 Bethesda assay用來定量血漿中第八因子抑制物（anti-factor VIII antibody）的效價，單位為 Bethesda unit（BU）。它不是用來測第九因子活性、診斷 A 型血友病本身或檢驗 lupus anticoagulant。 操作上，將病人血漿與正常混合血漿（pooled normal plasma）以 1：1 混合，置於 37℃孵育2小時，再測定殘餘第八因子活性。這種「混合後須長時間孵育」是第八因子抑制物的特徵。 1 BU的定義是：使正常血漿第八因子活性降為中和前 50％的抑制物量。殘餘活性每減半，效價增加 1 BU：50％為1 BU，25％為2 BU，12.5％為3 BU。 先天性血友病患者治療後產生的抑制物屬於同種異體抗體。重型患者（尤其具有第八因子基因倒轉者）的發生率高於輕型。臨床上若血友病人輸注凝血因子後治療無效，應懷疑出現抑制物並安排 Bethesda assay。 對第八因子或第九因子抑制物陽性的患者，應改用繞道製劑止血，例如重組活化第七因子（rFVIIa）或活化凝血酶原複合物（aPCC）。 核心觀念 一、第八因子抑制物的來源與危險因子 A 型血友病是凝血因子 VIII 缺乏。患者接受因子 VIII 輸注後，免疫系統可能把外來的因子 VIII 視為異物，產生能中和其活性的抗體。抑制物出現後，即使提高因子 VIII 劑量，也常無法有效止血。 臨床情況 抗體性質 重點 先天性血友病患者治療後產生 同種異體抗體（alloantibody） 原本缺乏因子 VIII，接觸外來因子 VIII 後產生免疫反應；動力學多屬第一型 後天性血友病 A 自體抗體（autoantibody） 無血友病病史，可見於老年人、產後、自體免疫疾病或惡性腫瘤；動力學多屬第二型 發生抑制物的風險與基因缺陷的嚴重度有關。第八因子基因倒轉（如 intron 22 inversion）、大片段缺失等重度缺陷多見於重型患者，這類患者的抑制物發生率明顯高於輕型血友病患者。 二、Bethesda assay 的原理與步驟 將病人血漿與正常混合血漿以 1：1 混合。效價高時，先把病人血漿做系列稀釋再混合。 對照組以正常血漿加等量緩衝液（或缺乏因子 VIII 的血漿）混合。 兩組同置 37℃孵育2小時（不是室溫），讓抑制物充分中和因子 VIII。 測定兩組的第八因子活性，求出殘餘活性：殘餘活性＝測試組 ÷ 對照組 × 100％。 依殘餘活性換算 BU。若有稀釋，再乘以稀釋倍數。 1 BU是指使第八因子活性降低至中和前50％（即減少50％）的抗體量。它不是「完全中和1 U 因子 VIII」，也和抗原量增加、抗體價數增減無關。 混合孵育後殘餘第八因子活性 Bethesda 效價 100％0 BU 50％1 BU 25％2 BU 12.5％3 BU 例如病人血漿為 3 BU，代表正常血漿與病人血漿混合孵育後，測得的殘餘第八因子活性為 12.5％。這個數字不是病人本身的第八因子活性，也不能解讀成 APTT 延長 3 倍。 依效價可將病人分為兩類：低反應者（通常小於 5 BU）與高反應者（5 BU 以上）。低效價抑制物仍會影響因子補充療效，不能在臨床上忽略。 三、傳統 Bethesda 法與 Nijmegen 修正法 比較項目 傳統 Bethesda 法 Nijmegen 修正法 用途 定量因子 VIII 抑制物效價 同上，改善低效價的準確度 正常混合血漿 未加緩衝 以 imidazole 緩衝至 pH 7.4，避免孵育中 pH 上升使因子 VIII 自行衰退 對照組／稀釋液 緩衝液 改用缺乏因子 VIII 的血漿 低效價敏感度與特異性 較差，易有偽陽性 較佳 Nijmegen 法的關鍵是緩衝正常混合血漿，並以缺乏因子 VIII 的血漿取代緩衝液。它不是「用 pH 7.4 imidazole 緩衝液與病人血漿 1：1 混合」。兩種方法的孵育條件相同，都是 37℃、2小時。 四、抑制物的動力學型態 第一型：多見於血友病患者的同種異體抗體。中和作用隨時間與濃度增加，可把因子 VIII 完全中和。殘餘活性隨效價增加而呈指數下降（取對數後才呈直線），效價越高，殘餘活性越低。兩者並非線性正比。 第二型：多見於後天性血友病的自體抗體。動力學複雜、呈非線性，無法完全中和因子 VIII，常留有部分殘餘活性，因此效價較難準確估算。 五、混合試驗與易混淆的抗體 第八因子抑制物屬於時間與溫度依賴性抑制。病人血漿與正常血漿混合後立即測 APTT，結果可能接近糾正；但經 37℃孵育2小時後，APTT 會再度延長。因此陽性病人在孵育後的 APTT 不會正常。 檢測對象 特性與檢驗方式 第八因子抑制物 與正常血漿 1：1 混合，37℃孵育2小時後延長更明顯；以 Bethesda assay 定量 Lupus anticoagulant 屬即時作用型，混合後立即測即可見延長、不需長時間孵育；以磷脂依賴性試驗（如 dRVVT）確認 Anticardiolipin、anti-β2 GPI 以免疫法（如 ELISA）測定抗體，不需混合孵育 六、何時要求 Bethesda assay 典型情境是血友病人接受凝血因子治療後無效，或出血控制變差、因子回收率下降。此外，混合試驗顯示時間依賴性抑制，或懷疑後天性血友病時，也會安排此檢查。出血時間延長、PT 延長或懷疑 lupus anticoagulant，都不是 Bethesda assay 的適應情境。 七、繞道止血治療 抑制物會中和補充進去的因子 VIII 或 IX，因此需改用繞過這兩個因子的製劑： 重組活化第七因子（rFVIIa）：高劑量時可在活化血小板表面直接活化因子 X，產生凝血酶，不需要因子 VIII 或 IX。對因子 VIII 或因子 IX 抑制物陽性者都適用。 活化凝血酶原複合物（aPCC）：含凝血酶原、因子 VII、IX、X，其中部分為活化形式，可促進凝血酶生成。由於含因子 IX，用於因子 IX 抑制物患者時須留意過敏或回憶性抗體上升。 繞道製劑有血栓風險，合併使用時尤須謹慎。對抑制物陽性的 B 型血友病患者單純補充因子 IX 無效。蛋白 C 是抗凝因子；因子 Va 則不是臨床使用的繞道製劑。 常考陷阱 「1 BU 是完全中和 1 U 因子 VIII」或「使抗原量／抗體價數增減 30％、50％」：錯誤。1 BU 是使因子 VIII 活性減少 50％（殘餘 50％）的抗體量。 「3 BU 表示病人因子 VIII 活性為 12.5％」：錯誤。12.5％是正常血漿與病人血漿混合孵育後的殘餘活性。 「3 BU 表示 APTT 延長 3 倍」：錯誤。BU 與 APTT 秒數沒有倍數關係。 「小於 5 BU 抗體極低，臨床可忽略」：錯誤。小於 5 BU 屬低反應者，仍有臨床意義。 「Bethesda assay 用來檢測第九因子活性、A 型血友病或 lupus anticoagulant」：錯誤。它定量的是第八因子抗體（抑制物）。 需要 1：1 混合後 37℃孵育2小時的是 anticardiolipin、anti-β2 GPI 或 LA：錯誤。這是第八因子抑制物的檢測條件。 「於室溫反應兩小時」：錯誤，應為 37℃。 「Nijmegen 法以 pH 7.4 imidazole 緩衝液與病人血漿 1：1 混合」：錯誤。被緩衝的是正常混合血漿。 「傳統 Bethesda 法對低效價比 Nijmegen 法更敏感」：錯誤，情況相反。 「第一型抗體效價與殘餘活性呈線性正比」：錯誤。效價越高，殘餘活性越低。 「血友病人治療後產生的抑制物為自體抗體」：錯誤，應為同種異體抗體。 「抑制物陽性者混合孵育後 APTT 正常」：錯誤，孵育後 APTT 仍延長。 「基因倒轉者的抑制物發生率低於輕型」：錯誤，基因倒轉者（多為重型）的發生率較高。 「PT 或出血時間延長時要求 Bethesda assay」：錯誤。應在血友病人治療無效時安排。 「抑制物陽性者用因子 IX、蛋白 C 或因子 Va 治療」：錯誤，應使用因子 VIIa（rFVIIa）或 aPCC。 記憶口訣 「一比一、三七度、等兩時；剩一半、算一單位；每減半、加一 BU（50、25、12.5）；Nijmegen 緩衝正常漿、低價更準；治不好、測 Bethesda；有抑制、七 a 繞道走。」