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學習重點 掌握HPLC由溶劑槽、泵、進樣器、管柱、偵測器至資料系統的流程。泵控制流速，因此會影響滯留時間。 選擇分離模式時，要同時判斷分析物的極性、酸鹼解離狀態與固定相的作用，不能只看「能否溶於移動相」。 高極性分析物可採HILIC或離子交換分析；具氧化還原活性的分析物可搭配電化學偵測。 分清正相與逆相的沖提力方向，並能依梯度時間、流速及梯度斜率判斷哪種條件能改善分離。 核心觀念 一、HPLC儀器構造與功能 典型流路為：溶劑槽→脫氣與混合裝置→高壓泵→進樣器→層析管柱→偵測器→廢液端，偵測訊號再送至資料系統處理。混合器與泵的先後位置，依低壓或高壓混合設計而不同，不宜把單一配置當成所有儀器的固定構造。 組件主要功能與考試連結 溶劑槽儲存移動相。溶劑須適當過濾與脫氣，以減少微粒堵塞、氣泡及訊號不穩。 泵提供推動移動相通過管柱的壓力，並維持設定流速。流速直接影響分析物通過管柱的時間，也就是滯留時間。 進樣器將一定體積的檢品導入流路，常以定量環或自動進樣器控制注入量。 層析管柱內含固定相，利用各成分與固定相、移動相作用的差異完成分離。 偵測器將流出成分的光學、電化學等性質轉換為訊號。檢測波長由相應的光學偵測系統設定。 管柱恆溫裝置控制層析溫度，協助穩定滯留與分離表現。 在管柱、移動相組成與溫度等條件相同時，流速增加通常使滯留時間縮短，流速降低則使滯留時間延長。等組成條件下，若滯留因子大致不變，滯留時間約與流速成反比。但流速也會影響管柱效率，不能推論「愈慢一定分得愈好」。 等組成沖提（isocratic elution）是指分析期間移動相組成維持不變，部分教材或題目稱為等度或等梯度沖提；梯度沖提則是隨時間改變移動相組成。兩者都需要溶劑槽、溶劑泵、進樣器、層析管及適當的偵測器。 火焰離子化偵測器（FID，或稱焰火離子偵測器）是氣相層析（GC）的偵測器。它必須以氫焰燃燒流出物，液態移動相本身也會產生大量訊號，因此不是HPLC的組成。HPLC常見的偵測器有UV/VIS、PDA、螢光、RI、電化學、MS等。 二、依極性與電荷選擇分離模式 分離模式固定相與保留原理選用重點 正相層析固定相較具極性，如矽膠；分析物依極性作用的差異分離。增加移動相的極性，通常會提高沖提力。 逆相層析固定相疏水，如C18；主要利用疏水作用保留分析物。高極性、明顯離子化的小分子通常保留較弱；增加有機溶劑比例，通常會提高沖提力。 HILIC親水作用層析使用親水性固定相，常搭配高比例乙腈及一定比例水的移動相。適合高極性分析物；保留機制可涉及水層分配、氫鍵及靜電作用。 離子交換層析固定相帶有電荷，保留帶相反電荷的分析物。須依分析物電荷選擇交換劑，並以pH、離子強度調整保留。 離子對層析使用逆相管柱，在移動相中加入帶相反電荷的離子對試劑。離子對試劑與離子性分析物形成電中性的離子對，增加分析物在逆相管柱上的保留。 Serine（絲胺酸）含胺基、羧基及羥基，親水性高。在足夠酸性的條件下，胺基質子化，整體呈淨正電，適合以陽離子交換保留。在足夠鹼性的條件下，羧基成為羧酸根，胺基較少質子化，整體呈淨負電，適合以陰離子交換保留。 陽離子交換劑本身帶負電，抓住陽離子；陰離子交換劑本身帶正電，抓住陰離子。名稱是依「被交換的離子」命名，不能反過來記。 未衍生化的serine在酸性條件下仍高度親水，又帶正電，在一般C18管柱上幾乎無法保留，會在死體積附近流出。因此，單純採酸性移動相搭配C18，是最不合適的策略。HILIC則適合處理這類高極性分析物；若使用鹼性條件，仍須確認管柱可耐受的pH範圍，但HILIC並不以鹼性為必要條件。 三、Ascorbic acid的分離與偵測選擇 Ascorbic acid（抗壞血酸、維生素C）極性高，具可解離的酸性烯醇基團，在一般pH下多以陰離子形式存在；其烯二醇結構也很容易氧化。選擇分析系統時，應分別考慮「如何保留」及「如何產生靈敏且具選擇性的訊號」。 保留：一般逆相管柱對抗壞血酸的保留不足。離子對層析可在移動相中加入四級銨鹽等陽離子性離子對試劑，與抗壞血酸陰離子配對，使其在逆相管柱上得到足夠保留。 偵測：抗壞血酸具電化學活性，容易在電極上被氧化。電化學偵測器的靈敏度與選擇性都高，適合製劑中低含量防腐劑的定量。 因此，離子對層析搭配電化學偵測器是所列分析系統中最適用的組合。 RI為折射率偵測器，IR為紅外線偵測，兩者不可混淆。RI屬通用型偵測器，但靈敏度低，且對溫度、移動相組成變化敏感，不適合梯度沖提，也不適合微量定量。IR則因水與多數有機移動相本身吸收強烈，並非HPLC常規定量用的偵測器。判斷的關鍵是抗壞血酸「易氧化」，不能單憑結構中「具有羥基」就選IR。 四、沖提力與梯度分離度調控 沖提力愈強，通常表示愈能使分析物離開固定相、降低其保留。但沖提力增加不等於分離度一定改善；若成分過快流出，反而可能重疊。 模式弱沖提溶劑增加沖提力的方式梯度方向 正相低極性溶劑，如己烷、氯仿增加極性溶劑比例，如在氯仿中逐漸增加甲醇移動相極性逐漸增加 逆相水（沖提力最小）增加乙腈或甲醇比例移動相極性逐漸降低 逆相梯度一般由較高的水比例開始，逐步提高有機溶劑比例，讓保留較強的成分依序流出。此時移動相的整體極性是逐漸降低，而不是增加。 比較梯度條件時，必須固定起始與終止組成、管柱及其他條件。若組成變化量相同，梯度時間愈長，每單位時間的組成變化愈小，梯度愈平緩，通常較有利於分開相近的成分。 在流速不變時，將梯度時間延長至原來的1.5倍，梯度斜率降為原來的2/3；將時間縮短至0.5倍，斜率則加倍。前者較有利於改善分離，代價是分析時間增加。 若流速也改變，可用梯度體積＝流速×梯度時間比較。同一管柱及相同組成範圍下，梯度體積愈大，每單位流經體積的組成變化愈緩，分離通常愈好。 條件梯度體積（相對值）分離趨勢 流速不變，時間×1.51.5最平緩，分離最佳 流速不變，時間×0.50.5梯度變陡，分離變差 流速×1.5，時間×0.50.75梯度變陡，分離變差 流速×0.5，時間×0.50.25最陡，分離最差 由上表可知，不能因為「流速降低」就判定分離一定改善，關鍵在梯度是否變得平緩。 常考陷阱 「泵決定檢測波長、層析溫度或檢品注入量」：泵主要控制移動相輸送與流速，最直接相關的是滯留時間。檢測波長由偵測器決定，溫度由管柱恆溫箱決定，注入量由進樣器決定。 「等梯度HPLC系統含火焰離子化（焰火離子）偵測器」：FID是GC的偵測器；溶劑槽、溶劑泵、層析管才是HPLC的組成。 「酸性移動相配C18適合分析serine」：須檢查極性與離子化狀態。未衍生化的serine過於親水且帶電，在C18上保留不足。酸性配陽離子交換、鹼性配陰離子交換，以及HILIC，都是合理的策略。 「陽離子交換固定相帶正電」：固定相與被保留的分析物電荷相反。 「抗壞血酸用逆相/RI或IR偵測最適當」：RI靈敏度低，IR非HPLC常規偵測器。應抓住「離子性→離子對」與「易氧化→電化學」兩個關鍵。 「逆相梯度應逐漸提高移動相極性」：這是錯誤敘述。逆相梯度應提高有機溶劑比例，移動相極性逐漸下降。以下敘述則都是正確的：「逆相中水的沖提力最小」、「正相在氯仿中增加甲醇可加大沖提力」、「逆相中增加乙腈比例可加大沖提力」。 「縮短梯度時間或降低流速可改善分離」：應以梯度體積（流速×時間）判斷。在流速不變下延長梯度時間，梯度最平緩，最能改善分離。 記憶口訣 「泵管流速定滯留，進樣管量，柱分離，偵測看訊號；FID屬GC。」 「正相加極性，逆相加有機；逆相梯度極性降，水最弱。」 「梯度放平緩，近峰較易分；流速乘時間，體積大者勝。」 「陽交換抓正，自己帶負；陰交換抓負，自己帶正。」 「維C帶負又怕氧，離子對加電化學。」