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學習重點 掌握 HILIC「親水固定相、富含有機溶劑的移動相、極性物質通常滯留較強」的分離特色，其極性滯留方向與正相層析相近。 理解水在 HILIC 中通常是較強的沖提溶劑，增加水比例一般會降低分析物滯留、使其較快被沖提出來。 知道 HILIC 除了分配作用外，也可能有氫鍵、吸附及靜電作用；強酸性或強鹼性化合物都可能發生離子交換。 判讀胺基酸結構時，同時比較親水官能基與疏水碳骨架，能推出絲胺酸在 HILIC 中較晚沖提。 辨認胺丙基矽膠管柱是常見的醣類分析選擇，並依醣類缺乏強紫外吸收的特性選擇偵測方式。 核心觀念 一、HILIC 的固定相與分離機制 親水性交互作用層析法（hydrophilic interaction liquid chromatography，HILIC）使用親水性的固定相，例如裸矽膠、胺基、醯胺基或兩性離子型固定相；移動相則常使用乙腈與水或水性緩衝液的混合液，且通常具有較高的乙腈比例。 親水固定相表面可形成相對富水的液層，分析物在此液層與富含有機溶劑的主體移動相間分配，是重要的滯留來源。此外，氫鍵、吸附及靜電作用也可能參與分離，因此不能把 HILIC 視為只有單一分配機制的層析。 基本判斷為：分析物越親水、極性越高，通常越容易滯留；較疏水者通常較早沖提。這種極性滯留方向與正相層析相近，與一般逆相層析相反；但 HILIC 使用含水移動相，不能與傳統正相層析完全畫上等號。 比較項目HILIC一般逆相層析 固定相特性親水、極性較高疏水，例如 ODS／C18 移動相高比例乙腈＋少量水或緩衝液水或緩衝液＋甲醇、乙腈等 主要適用對象高極性、親水性化合物具有適當疏水性的化合物 一般滯留方向親水性較高者滯留較強、較晚出峰疏水性較高者滯留較強、較晚出峰 較強的沖提溶劑水有機溶劑 增加移動相水比例通常使滯留降低、較快沖提通常使疏水性分析物滯留增加 二、水比例與離子交換作用 在典型 HILIC 條件下，水是較強的沖提溶劑。增加移動相的水比例，通常使分析物較容易離開固定相而被沖提出來，滯留時間縮短；提高乙腈比例則通常增加親水性分析物的滯留。因此，不能將逆相層析的溶劑強度規則直接套用於 HILIC。 HILIC 固定相或分析物可能帶電，因此也可能發生離子交換。例如，帶負電的矽醇基可與帶正電的分析物（如鹼性化合物）作用；質子化而帶正電的胺基固定相則可能與帶負電的分析物（如酸性化合物）作用。強酸性或強鹼性化合物，都可能在適當條件下參與離子交換。 是否發生及作用強弱，須看分析物與固定相的電荷狀態，以及移動相的酸鹼值、緩衝鹽種類與濃度。不能只看化合物「極性高低」，就斷定所有條件下的沖提順序。 三、胺基酸的結構與波峰判讀 胺基酸同時具有胺基與羧基，其解離狀態會受酸鹼值影響。比較多種胺基酸時，應先找共同骨架，再比較側鏈的親水官能基、碳鏈大小及芳香環。在相同條件下，羥基通常提高親水性；增加烴基或芳香環則增加疏水部分。 胺基酸側鏈結構重點判讀關鍵 Serine，絲胺酸側鏈為 —CH₂OH具有羥基且碳骨架最小，四者中親水性最強 Threonine，蘇胺酸側鏈為 —CH(OH)CH₃同樣具有羥基，但比絲胺酸多一個甲基，親水性稍弱 Tyrosine，酪胺酸具有帶酚羥基的芳香環兼有親水羥基與疏水芳香環，不能只憑有羥基就認定最親水 Phenylalanine，苯丙胺酸具有苄基，側鏈無羥基芳香側鏈疏水性明顯，四者中最疏水 依上表，四者親水性大致為：絲胺酸 ＞ 蘇胺酸 ＞ 酪胺酸 ＞ 苯丙胺酸。在 HILIC（類似正相）條件下，沖提先後大致為苯丙胺酸最早、絲胺酸最晚。因此若圖譜中某個較後段的波峰須在這四者中選擇，應選親水性最強的絲胺酸；苯丙胺酸則應出現在前段。 解題時須先確認橫軸（時間）方向及波峰位置，再配合結構判斷；波峰字母本身不代表固定物質，圖中若還有其他胺基酸，也要用同樣的「親水性高者晚出」原則一併比較。 四、醣類分析管柱與偵測條件 醣類含有多個羥基，通常極性高、親水性強，在一般未衍生化的逆相 ODS 管柱上往往滯留不足。胺丙基矽膠管柱（aminopropyl silica gel）帶有極性的胺基，是最常見、最適用的醣類分離管柱，可搭配乙腈與水的移動相，利用親水性交互作用等機制分離醣類。 比較 ODS、胺丙基矽膠及未指定條件的陽離子、陰離子交換管柱時，分析一般醣類應優先選胺丙基矽膠。但「醣類只能使用胺基管柱」並不正確：特定陽離子交換樹脂可用於醣類的配位體交換分離；高效陰離子交換層析則可在強鹼條件下搭配脈衝安培偵測分析醣類，均須有相應條件支持。 多數未衍生化的單醣與雙醣缺乏適合一般紫外偵測的強發色團，因此不能直接把常用紫外波長當成理所當然的最佳選擇。常見偵測方式包括折射率偵測器（RI）及蒸發光散射偵測器（ELSD）；若採紫外或螢光偵測，通常需視醣類本身結構或適當衍生化而定。 RI 偵測容易受溫度及移動相組成變化影響，通常搭配恆溫、等度沖提。ELSD 則須注意移動相的揮發性，避免使用不揮發性鹽類造成干擾。 常考陷阱 「HILIC 與逆相層析的分離機制類似」：錯誤。HILIC 使用親水固定相，滯留方向與正相相近，與逆相相反。 「極性越高的化合物越不易滯留」：與 HILIC 趨勢相反；高極性、高親水性物質滯留較強。 「移動相水含量越多，化合物越慢被沖提出來」：錯誤。HILIC 中水是強沖提溶劑，水越多沖提越快、滯留時間越短。 「HILIC 沒有離子交換作用」：錯誤。分析物與固定相若帶有適當電荷，強酸性或強鹼性化合物皆可能發生離子交換。 「酪胺酸有羥基，所以在 HILIC 最晚出峰」：判斷不足；酪胺酸的芳香環使其疏水性增加，四者中最晚出峰的是絲胺酸。 「苯丙胺酸分子較大，所以較晚出峰」：錯誤。HILIC 依親水性滯留，苯丙胺酸最疏水，應最早出峰。 「醣類分析選 ODS 管柱」或「直接選陽／陰離子交換管柱」：題目未給特殊條件時，最適用醣類分析的是胺丙基矽膠管柱。 「醣類直接用一般 UV 偵測即可」：未衍生化醣類紫外吸收弱，常用 RI 或 ELSD。 記憶口訣 「親水柱留親水，水增多、早出來；糖找胺基柱，偵測想到 RI。」 胺基酸出峰順序：「苯酪蘇絲，越後越親水」（苯丙胺酸 → 酪胺酸 → 蘇胺酸 → 絲胺酸）。 遇到帶電分析物，另加一句：「酸鹼看電荷，皆可離子交換。」