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學習重點 粒徑排除層析依分子能否進入凝膠孔隙及進入的程度來分離，大分子先沖出，小分子後沖出。 凝膠過濾與凝膠滲透的原理相同，差別在於移動相是水性或有機溶媒，以及搭配的典型固定相。 在有效分離範圍內，沖出體積與分子量對數呈負向線性關係，考題常寫成「Ve與log M成反比例」。 玻尿酸等高分子多醣，最適合用分子篩層析進行分析、分離與純化。 硼酸親和層析利用硼酸基固定相與糖化血紅素糖基上的順式二醇基結合，測定糖化血色素時應選用borate gel。 核心觀念 一、粒徑排除層析：依孔隙可及程度分離 粒徑排除層析（size exclusion chromatography，SEC）也稱為分子篩層析、分子排斥層析（molecular exclusion chromatography）或斥濾層析。固定相是具有一定孔徑分布的多孔性材料。移動相會流經顆粒之間的間隙，也會流經顆粒內部的孔隙。不同分析物在溶液中的有效分子尺寸不同，能進入的孔隙體積也不同，因此沖出時間與沖出體積不同。 大分子：難以進入孔隙，主要隨顆粒間的移動相前進，因此較早沖出。 中等分子：只能進入部分孔隙，沖出位置介於大分子與小分子之間。 小分子：能進入較多孔隙，可流經的體積較大，因此較晚沖出。 理想的SEC只依尺寸排除分離，不涉及疏水性分配、表面吸附或離子交換。題目若描述「分析物因分子量大小不同，進入靜相孔隙的程度不同而分離」，指的就是SEC。分子量常被用來推估分子大小，但兩者並不完全相同，分子形狀、構形及在溶劑中的伸展程度都會影響沖出位置。 二、凝膠過濾與凝膠滲透的辨認 凝膠過濾（gel filtration）與凝膠滲透（gel permeation）都屬於粒徑排除層析，都遵守大者先出、小者後出的規則。兩者名稱不同，主要反映移動相與應用對象的差異。 比較項目凝膠過濾（GFC）凝膠滲透（GPC） 常見移動相水溶液、緩衝溶液有機溶媒 常見分析對象蛋白質、多醣等親水性大分子可溶於有機溶媒的合成聚合物 典型固定相交聯葡聚糖（Sephadex）、瓊脂糖（agarose）、聚丙烯醯胺（polyacrylamide）凝膠與有機溶媒相容的多孔交聯聚合物，例如交聯聚苯乙烯 主要分離依據分子尺寸及孔隙可及程度分子尺寸及孔隙可及程度 題目若出現以aqueous buffer為移動相、以Sephadex為固定相，答案就是凝膠過濾，也就是SEC。Sephadex是交聯葡聚糖凝膠的商品名稱。不要因為使用緩衝液就判斷為離子交換層析；只有接上離子交換基團的衍生物（例如DEAE-Sephadex）才屬於離子交換材料。 三、固定相材料與軟凝膠 凝膠過濾常用的固定相有agarose（瓊脂糖）、polyacrylamide（聚丙烯醯胺）及交聯dextran（葡聚糖）。這些材料會形成具有孔隙的親水性凝膠網狀結構，適合分離親水性大分子。 聚丙烯醯胺是典型的軟凝膠（soft gel），可用於分離蛋白質等親水性大分子。氧化鋁（alumina）、玻璃珠（glass bead）及一般矽膠（silica gel）都屬於硬質無機材料，不是軟凝膠；其中氧化鋁與矽膠是典型的吸附層析材料。 蔗糖（sucrose）不能作為分子排斥層析的固定相。蔗糖是可溶性的小分子雙醣，無法形成多孔的網狀結構。葡聚糖可以交聯成多孔凝膠，但不能因此推論「含糖的物質」都可以當固定相。 依傳統教材的分類，凝膠滲透搭配有機溶媒與交聯聚合物固定相，「Silica gel為Gel permeation之固定相」是錯誤敘述。另外三項敘述都正確：agarose是凝膠過濾的固定相、凝膠過濾以水溶液為移動相、凝膠滲透以有機溶媒為移動相。 四、沖出體積與分子量的關係 沖出體積（Ve）是指分析物從注入到沖出所需的移動相體積。Ve會落在空隙體積（V0，完全不能進孔的分子）與管柱總滲透體積（完全進孔的小分子）之間。在同一層析系統的有效分離範圍內，用已知分子量的標準品校正，可得到下列關係： Ve＝a－b log M（b為正值） 由此可知，分子量M增加時，log M增加，沖出體積減少。選項若分成「與M成正比或反比」及「與log M成正比或反比」，應選Ve與log M成反比例，也就是負斜率的直線關係。嚴格來說，這不是Ve＝常數／log M。 分子大於孔徑排除上限時都無法進孔，會一起在空隙體積附近沖出。分子小到可以完全進孔時，彼此之間也無法再依尺寸區分。因此，校正關係只能用在有效範圍內，不能任意外推。 五、玻尿酸等高分子多醣的分析 玻尿酸（hyaluronic acid）是高分子量的多醣體。不論題目問分離、純化或分析，答案都是分子篩層析（SEC）。判斷關鍵在於它的分子尺寸很大。 正相、逆相液相層析依極性或親脂性分配分離，不適合這類高分子多醣。 玻尿酸雖然帶有羧基，但題目考的是高分子的分離，不應優先選離子交換層析。 氣相層析需要分析物能夠揮發，不適用於高分子多醣。 酸鹼滴定法只能定量酸性基團，無法依分子大小分析。 六、糖化血色素（HbA1c）的硼酸親和層析 硼酸親和層析利用固定相上的硼酸基或硼酸鹽基團（boronate），在適當條件下與糖化血紅素糖基上的順式二醇基（cis-diol）形成可逆的環狀酯結合。糖化血紅素會被固定相保留，未糖化的血紅素則直接流出。之後再用含有競爭性二醇的溶液（例如sorbitol）沖提，即可將兩者分離並定量。 辨識部位：葡萄糖接上血紅素後所帶有的順式二醇結構。 適合固定相：borate gel，也就是帶有硼酸親和基團的凝膠。 分離原理：固定相與特定化學結構之間的親和作用，與分子尺寸無關。 ODS（十八烷基矽烷，C18）是逆相固定相，silica gel與alumina是吸附層析固定相，三者都沒有辨識順式二醇的硼酸基團。另外要注意，硼酸親和法辨識的是糖化結構，測得的是總糖化血紅素，不只是HbA1c這一種分子型態，實際報告時需依方法換算。 常考陷阱 「分子越大，沖出越慢」：這是把SEC想成大分子通過窄孔比較慢。實際上大分子不能進孔，所以先沖出。 「依親脂性基團在靜相或移動相的分布係數分離」：這是分配或逆相層析的機轉。「與移動相離子競爭交換體」是離子交換的機轉。SEC的關鍵字是進入孔隙的程度。 「Ve與M成反比」或「Ve與log M成正比」：都不對，正確答案是Ve與log M成反比，也就是負斜率直線。 「緩衝液加Sephadex就是離子交換」：Sephadex本身是凝膠過濾材料，水性緩衝液加Sephadex是典型的SEC組合。 「蔗糖可當分子篩固定相」：蔗糖是小分子雙醣，不是交聯網狀凝膠，不能取代dextran、agarose或polyacrylamide。 「alumina、glass bead、silica gel是軟凝膠」：這些都是硬質無機材料，屬於soft gel的是polyacrylamide。 「Silica gel為Gel permeation的固定相」：依考試的分類這是錯誤敘述。凝膠滲透搭配有機溶媒與交聯聚合物。 「凝膠過濾用有機相，凝膠滲透用水相」：兩者剛好相反，記成「水過濾、有機滲透」。 「玻尿酸用離子交換、逆相或GC分析」：高分子多醣一律選分子篩層析。 「HbA1c選ODS、silica gel或alumina」：正確的配對是borate gel加順式二醇基。 記憶口訣 「大不入孔先出，小能入孔後出；水過濾，有機滲透。」 「量大體積小，對數成反比。」分子量越大，Ve越小，關係式為Ve對log M的負斜率直線。 「軟膠三寶：葡聚、瓊脂、丙烯醯胺；蔗糖矽膠不入列。」 「硼抓順二醇，糖化被辨認。」看到HbA1c就選borate gel。