毛細管電泳效率與偵測條件

MoAI - 您的AI助手

建立於 2026年10月22日

學習重點 掌握毛細管電泳（CE）相較於一般HPLC的優勢：理論板數高、解析力高、分析時間短、樣品與有機溶劑用量少、較環保、毛細管便宜；濃度靈敏度與再現性不是CE的優點。 理解毛細管區帶電泳（CZE）的帶加寬來源：縱向擴散（最主要）、焦耳熱、進樣區帶長度；渦流擴散與質量轉移屬於填充式層析的機制，不是CZE的典型原因。 建立毛細管內徑、散熱、電壓、溶液黏度與電滲流（EOF）之間的關係。 區分各種CE分離模式，知道分離中性物質要用膠束電動層析法（MEKC）。 依分析物的光學特性選擇偵測方式：UV–Vis、雷射激發螢光、電化學（含脈衝安培法）是常用方法，折光率法不是；分析物不吸收UV時可用間接UV偵測。 核心觀念 一、CE與HPLC的比較：哪些是優點，哪些不是 CE在填充背景電解質的細熔矽毛細管兩端施加高電壓，依分析物遷移速度的差異分離，可應用於小分子離子、藥物、蛋白質與核酸等。所需樣品量只有奈升級，背景電解質多為水溶液，有機溶劑消耗少，因此節省資源、較環保。 比較項目CE相對於一般HPLC是否屬CE優點 理論板數（分離效率）較高，常達數十萬以上是 解析力（resolution）較高，因分離效率高是 分析時間較短是 樣品用量較少是 有機溶劑用量、環保性用量少、較環保是 管柱成本未填充的熔矽毛細管較便宜是 濃度靈敏度較低：進樣體積小、UV光徑短否 再現性較差：受進樣量、管壁狀態、EOF、溫度影響否 CE理論板數高的原因：一般CZE沒有填充粒子與固定相，沒有渦流擴散與質量轉移阻力；而且EOF的流型近似平頭的「栓狀流」（plug flow），不像壓力驅動的HPLC呈拋物線狀層流，區帶不易被拉寬。 藥典較常採用HPLC而不用CE，主要理由是HPLC再現性佳，定量結果穩定。「有機溶媒耗量少、分析時間短、解析度較佳」都是CE的特色，不是選擇HPLC的理由。 比較各分析方法的理論板數時，薄層層析法（TLC）通常最低。毛細管GC與CE都屬高效率方法，HPLC居中。 二、CZE的分離原理與帶加寬 CZE使用均相背景電解質與固定電場，依分析物電泳移動率（與電荷／大小比有關）的差異分離。 因素是否為CZE帶加寬原因說明 縱向擴散（longitudinal diffusion）是，最主要分析物沿管軸由高濃度向低濃度擴散；遷移時間越長，加寬越明顯。 焦耳熱（Joule heating）是電流通過電解質產熱；散熱不足會造成徑向溫度梯度，使黏度與移動率不均。 進樣區帶長度（injection plug length）是起始樣品區帶過長，初始寬度就大。 其他：管壁吸附、電導度不匹配可能分析物吸附管壁，或樣品與背景電解質電導差異大，造成拖尾或變形。 渦流擴散（eddy diffusion）否填充床中多重流路造成，未填充的毛細管沒有此機制。 質量轉移（mass transfer）否流動相與固定相間交換不及造成，均相CZE沒有固定相。 散熱良好時，提高電壓可縮短遷移時間，減少縱向擴散的累積，使效率提高；但電壓過高會加劇焦耳熱。所以「增加電壓」不是CZE帶加寬的主要因子。 三、毛細管內徑、黏度與電滲流 內徑越細，表面積與體積比越大，散熱越好，也可降低電流與產熱。內徑變大會使散熱變差、溫度梯度變大，因此「內徑越大散熱越佳」是錯的。常用內徑約25～100 μm。 電泳移動率與電荷成正比，與介質黏度及離子大小成反比：黏度越大，電泳移動率越小。分析物的實際移動速度，是自身電泳速度與EOF速度的向量和。 未塗層熔矽毛細管在約pH 7時，內壁矽醇基（Si–OH）解離成Si–O⁻而帶負電，吸引溶液中陽離子形成電雙層。施加電場後，這些陽離子朝陰極移動並帶動整體溶液，形成由陽極流向陰極的EOF。EOF通常強於多數離子的電泳速度，所以陽離子、中性分子、陰離子都會被帶往陰極端偵測，出峰順序一般為：陽離子 → 中性分子 → 陰離子。 CE的分離不只由電壓決定。電壓提供驅動力，緩衝液pH、離子強度、黏度、管壁狀態與添加劑（界面活性劑、環糊精等）都會影響遷移與選擇性；進樣也可使用壓力或虹吸。 四、CE的分離模式與中性物質 模式分離依據適用對象 毛細管區帶電泳（CZE）電荷／大小比造成的電泳移動率差異帶電分子；中性分子會一起隨EOF移動，無法彼此分開 膠束電動層析法（MEKC）中性分子在水相與膠束（擬固定相）間的分配差異中性（不帶電）分析物，也可分析帶電物質 毛細管膠體電泳（CGE）膠體篩分，依分子大小分離蛋白質、核酸（DNA片段） 毛細管等電聚焦（CIEF）在pH梯度中依等電點（pI）聚焦蛋白質、胜肽等兩性分子 毛細管等速電泳（CITP）在前導與尾隨電解質間依移動率排列成連續區帶帶電離子 MEKC在背景電解質中加入濃度高於臨界微胞濃度的界面活性劑，常用十二烷基硫酸鈉（SDS），形成帶負電的膠束。中性分子與膠束的親和力不同，遷移時間就不同，因此可以分離。結論是「CE無法分離中性物質」是錯誤敘述，只是需要選對模式。 五、偵測條件：依分析物的光學特性選擇 CE常用的偵測方法： UV–Vis吸收：最常用，通常在管上（on-column）直接偵測。 雷射激發螢光（LIF）：靈敏度極高，適合本身具螢光或經螢光衍生化的分析物。 電化學偵測：包括安培法、脈衝安培法、電導度法，適合具電化學活性的分析物。 質譜（CE-MS）。 折光率法（RI）不是CE的常用偵測方法：毛細管偵測體積極小，RI靈敏度不足，且對溫度變化非常敏感。 毛細管內直接UV偵測的光徑等於內徑（約50～75 μm），依比爾定律吸光度與光徑成正比，所以訊號小。加上進樣體積極小，CE的濃度靈敏度通常低於HPLC。樣品用量少與高效率，都不等於濃度靈敏度高。 分析物不吸收UV時，可使用間接UV偵測。做法是在背景電解質中加入會吸收UV、且電荷符號與分析物相同的離子，讓基線維持高吸光值。分析物區帶通過時會依電中性原則置換吸光背景離子，吸光度下降，形成負峰而被偵測。 以CE接UV偵測分析抗氧化劑metabisulphite（S2O5²⁻，陰離子，本身UV吸收弱）時，應選擇50 mM Tris + 15 mM pyromellitic acid（均苯四甲酸），pH 8.0。均苯四甲酸在pH 8.0解離成多價陰離子，具強UV吸收，可作為間接UV偵測的吸光背景離子；其移動率也與小分子無機陰離子相近，峰形較佳。其他選項不適用的原因如下： 磷酸鹽與硼酸鹽在一般偵測波長幾乎不吸收UV，無法提供吸光背景。 SDS用於形成膠束（MEKC），不提供吸光背景。 β-環糊精用於掌性或選擇性分離，也不提供吸光背景。 常考陷阱 「CE再現性較好」「HPLC再現性較差」：錯。再現性是HPLC的優勢，也是藥典採用HPLC的理由。 「CE靈敏度較高」「濃度靈敏度高」：錯。光徑短、進樣量小，濃度靈敏度是CE的弱點。 「HPLC解析度較佳」：錯。CE理論板數高，解析力較高。 「理論板數高、解析力高、分析時間短、溶劑少、較環保、管柱便宜、樣品量少」：都是CE的優點。題目問「何者不是優點」時，應選再現性或靈敏度。 「質量轉移、渦流擴散是CZE帶加寬原因」：錯，這兩者屬填充層析。CZE帶加寬的最主要因子是縱向擴散，焦耳熱與進樣區帶長度也會造成加寬。 「增加電壓是帶加寬最主要因子」：錯。適度提高電壓可縮短時間、減少擴散。 「毛細管內徑越大，散熱越佳」：錯。內徑越細，散熱越好。 「黏度越大，電泳移動率越大」：錯。黏度越大，移動率越小。 「CE無法分離中性物質」：錯。MEKC可分離中性物質；CZE、CIEF、CITP都不適合分離中性分子。 「pH 7熔矽管中EOF由陰極流向陽極」：錯。EOF由陽極流向陰極。 「CE分離僅用電壓」：錯。pH、黏度、添加劑、管壁狀態都會影響分離。 「折光率法是CE常用偵測法」：錯。UV–Vis、LIF、脈衝安培法才是常用方法。 「不吸收UV就不能用UV偵測」：錯。可在背景電解質中加入吸光離子（如pyromellitic acid）做間接UV偵測。 記憶口訣 「板高、解析快、量少省錢又環保；再現、濃敏輸HPLC。」這兩句區分CE的優點與兩大弱點。 「縱擴、焦耳、進樣長；渦流、傳質不上場。」前三者是CZE帶加寬原因，以縱向擴散為主；渦流擴散與質量轉移不是。 「細管散熱、黏大慢走；中性找膠束；自身不吸光，均苯四酸當背景；RI不上場。」串連內徑、黏度、MEKC、間接UV偵測與偵測器選擇的判斷重點。