阿摩線上測驗
登入
阿摩線上測驗
登入
學習重點 蛋白質藥物的主要限制：容易被蛋白酶分解，構形與安定性受環境影響，也可能因清除太快而縮短作用時間。 定點突變可以減少蛋白酶切割、分子間雙硫鍵或特定位點的醣基化；但安定性提高不代表沒有免疫原性。 N-linked 與 O-linked 醣基化各接在哪種胺基酸要分清楚；醣鏈末端接上唾液酸可延長半衰期。 熟記 PEG 的全名與作用、pegademase 的組成，以及蛋白質製劑的吸附與貯存原則。 胜肽擬態藥物的定義是「模擬天然胜肽結構或生物活性的藥物」。 核心觀念 一、蛋白質藥物的性質與修飾目的 蛋白質藥物要有正確的立體構形才有活性。造成失活的原因包括蛋白酶水解、化學降解、雙硫鍵接錯、變性與聚集；在體內的作用時間還受腎臟、肝臟等清除途徑影響。安定性與半衰期彼此相關，但不是同一個概念：製劑中的構形較安定，不代表體內清除一定變慢；循環時間延長，也不代表所有降解問題都已解決。 選擇修飾方式時，先找出主要問題再對症處理： 容易被蛋白酶切割：改變切割位置。 非配對半胱胺酸造成聚集：置換該殘基。 清除過快：評估醣鏈設計或 PEG 修飾。 無論採用哪一種改變，都必須同時保住生物活性。 二、定點突變：針對特定胺基酸改善性質 定點突變（site-directed mutagenesis）是改變特定的 DNA 序列，使蛋白質指定位置的胺基酸改變。它可以把不穩定的胺基酸換成較穩定的胺基酸，藉此增加蛋白質藥物的穩定性。重點在於選對位置與替換的殘基，而不是增加胺基酸的數目。 代表例子改變方式判讀重點 GM-CSF將蛋白酶切割位置的 arginine 改為 leucine改變蛋白酶辨識的位置，減少水解（正確敘述）。 人類 β-interferon將非配對的 cysteine 改為 serine減少不必要的分子間雙硫鍵，降低聚集機會（正確敘述）。 組織型纖溶酶原活化劑（tPA）將特定 asparagine 改為 glutamine移除該位置的 N-linked 醣基化接受點，減少蛋白質醣化（正確敘述）。 cysteine 有可形成雙硫鍵的硫醇基（-SH），serine 只有羥基（-OH），所以把非配對的 cysteine 換成 serine 是有意義的設計。但維持正常構形所需的雙硫鍵不能任意移除。同樣地，並不是每個 asparagine 都會被醣基化，要看它是否位在合適的醣基化序列上。 定點突變不能保證藥物沒有致敏性或免疫原性。序列改變反而可能產生新的免疫辨識位點，仍須實際評估。看到「由本技術產生的蛋白質無致敏性」這類絕對化的說法，應判為錯誤。 三、真核細胞的轉譯後修飾 以真核細胞製備重組蛋白時，細胞具備內質網與高基氏體等胞器，可以進行醣基化，以及雙硫鍵形成與正確摺疊（disulfide folding）。正確的雙硫鍵與摺疊是蛋白質建立立體結構與活性的基礎；實際修飾結果仍取決於宿主細胞與蛋白質本身。 項目典型位置或意義辨識關鍵 N-linked glycosylation醣鏈接在 asparagine（Asn）側鏈醯胺基的氮上Asn 配 N-linked。 O-linked glycosylation醣鏈接在 serine 或 threonine 側鏈羥基的氧上Ser、Thr 配 O-linked。 Disulfide foldingcysteine 之間形成正確雙硫鍵並完成摺疊真核表現系統可以進行的重要加工。 N-formylmethionine原核生物（細菌）轉譯起始時使用的胺基酸不是真核細胞在轉譯後於 N 端加上的修飾。 四、醣鏈末端的唾液酸與半衰期 在宿主細胞製備重組醣蛋白時，蛋白質上會先接上數目不等的單醣，最後在醣鏈末端接上唾液酸（sialic acid）。醣鏈如果缺少末端唾液酸，底下的半乳糖會暴露出來，容易被肝細胞的去唾液酸醣蛋白受體（asialoglycoprotein receptor）辨識並清除。末端有唾液酸時，就能避開這種清除。 因果關係是：末端唾液酸化 → 減少肝臟辨識與攝取 → 延長重組蛋白的半衰期。不要把它寫成促進肝細胞吸收或促進雙硫鍵摺疊。唾液酸雖然帶有酸性基團，也不能據此說它會提高蛋白質的 pH 值。 五、PEG 修飾與代表藥物 PEG 是 polyethylene glycol，中文為聚乙二醇。PEGylation 是把 PEG 鏈以共價鍵接到蛋白質上。這樣可以： 增加分子的水合體積，降低腎臟過濾清除。 提供空間遮蔽，減少蛋白酶接近與免疫辨識。 因此 pegylated protein 的半衰期比未修飾的蛋白質長。修飾的位置與程度可能影響活性，需一併評估。 Pegademase 是 adenosine deaminase（腺苷去胺酶，ADA）與 PEG 的共軛結合物，用於治療 ADA 缺乏造成的嚴重複合型免疫缺乏症。PEG 不是胜肽，全名中沒有 polypeptide；PEG 修飾是 PEG 與蛋白質的共價共軛，不是形成雙硫鍵的聚合物。 六、蛋白質製劑的安定化與貯存 給藥途徑：蛋白質藥物多為水溶性，但口服後會被胃酸與胃腸道蛋白酶破壞，跨越腸道上皮的能力也很差。因此水溶性不等於適合口服，臨床上以注射劑為主。蛋白質雖然對 pH 敏感，仍可用適當的緩衝液與配方製成針劑。 吸附：低濃度的蛋白質容易吸附在塑膠或玻璃容器表面，造成有效劑量流失。製劑中加入血清白蛋白（albumin），可以讓白蛋白先佔據容器表面，減少蛋白藥物被吸附。這是蛋白質製劑的典型特點。 貯存溫度：多數蛋白質藥物以冷藏（約 2～8℃）保存，實際仍依各產品仿單規定。不能一律說「通常貯存於室溫」，也不能說「通常貯存在零下 20℃」。冷凍與反覆凍融會造成冰晶界面壓力、局部濃縮與 pH 變化，導致聚集或失活。 pH：最穩定的 pH 依蛋白質而異（與等電點、降解途徑有關），pH 7.0 並不是通用的穩定條件。 七、胜肽擬態藥物 胜肽擬態藥物（peptidomimetics）是模擬天然胜肽的重要結構特徵或生物活性，以產生相應藥理作用的擬蛋白質（擬胜肽）藥物。設計時保留與受體或酵素作用所需的關鍵基團，並修改骨架、胜肽鍵或構形，以提高抗蛋白酶分解能力、選擇性、口服可用性或改善藥物動力學性質。 它的本質是藥物，不是蛋白質分析方法，不是蛋白質合成技術，也不是天然的功能性蛋白質。 常考陷阱 「定點突變產生的蛋白質無致敏性」：錯。安定性改善不代表免疫反應消失，絕對化的敘述要特別警覺。 具體的突變實例：GM-CSF 的 Arg→Leu、β-interferon 的 Cys→Ser、tPA 的 Asn→Gln 減少醣化，都是正確敘述。不要因為內容冷僻就誤判為錯誤選項。 「增加胺基酸數目可增加穩定性」：錯。正確的方法是以定點突變取代不穩定的胺基酸。 「Asn 上進行 O-glycosylation」「Thr 上進行 N-glycosylation」：位置對調了。應為 Asn 接 N-linked，Ser、Thr 接 O-linked。 「真核細胞在 N 端接上 N-formylmethionine」：錯。這是原核生物的轉譯起始特徵；真核細胞可進行的是 disulfide folding。 「接上唾液酸會促進肝細胞吸收、促進 disulfide folding、提高 pH」：都錯。正確答案是延長半衰期。 「PEG 全名為 polypeptide ethyl glycol」：錯。正確為 polyethylene glycol。 「PEG 與蛋白質形成雙硫鍵聚合物」「PEG 化後半衰期較短」：都錯。PEG 是共價共軛修飾，作用是延長半衰期。 「蛋白藥物多為水溶性，適合口服」：錯。會被胃腸道分解且吸收差。 「蛋白藥物易受 pH 影響，不適合作成針劑」：錯。蛋白藥物正是以針劑為主。 「通常貯存在零下 20℃」「通常貯存於室溫」「維持在 pH 7.0 即可穩定」：都錯。貯存多為冷藏且依產品而定，最適 pH 依蛋白質而異。 Peptidomimetics 被說成分析方法、合成技術或功能性蛋白質：錯。正確為擬蛋白質之藥物。 記憶口訣 「Asn 接 N，Ser、Thr 接 O；真核會摺雙硫，fMet 屬細菌。」 「唾液酸封尾，肝臟抓不到，半衰期變長。」 「PEG 聚乙二醇，ADA 接上成 pegademase；白蛋白擋吸附，冷藏看仿單。」 「突變換穩定，但不保證不過敏；擬胜肽是藥，不是技術。」