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學習重點 分清波長與吸光度校正：前者確認光譜位置，後者確認吸光度讀值；同一標準物質可能具有不只一種校正用途。 掌握校正材料：氧化鈥、Didymium 濾光鏡與水銀蒸氣燈是典型波長校正工具；重鉻酸鉀也可依其光譜特徵用於波長確認，不能限定它只能校正吸光度。 吸光度適中較準確：一般以約 0.2～0.8 作為實用量測範圍；吸光度太低或太高，都可能增加濃度測定的相對誤差。 記住特徵吸收：卟啉約 400 nm 的強吸收稱為 Soret 帶；分析物本身的吸收峰與檢驗反應產物的量測波長必須分開理解。 辨認常規技術：分光光度法、螢光法及離子選擇性電極常用於臨床生化；圓偏光二色性主要用於分子構形與手性研究。 核心觀念 一、波長校正與吸光度校正 波長校正是確認儀器設定的波長與實際光譜位置是否一致。適用標準應具有已知、穩定且可辨識的吸收峰、吸收谷或發射譜線，藉由比對其位置判斷波長是否偏移。 吸光度校正又稱光度準確度確認，是在指定條件與波長下，比較標準物質的測得吸光度與參考值。其重點在讀值大小，而非峰的位置。校正時須依標準物質的規定使用，不能忽略濃度、溶劑、光程及儀器光譜帶寬等條件。 材料用途與考試判斷 氧化鈥具有多個特徵吸收峰，可用於波長校正。辨識元素時應記住「鈥」，不是鈦、鉑或銫。 Didymium 濾光鏡利用已知吸收峰確認波長準確度，為典型波長校正工具。 水銀蒸氣燈提供已知位置的銳利發射譜線，可用於波長校正；此處利用的是發射線，不是溶液吸收峰。 重鉻酸鉀溶液常用於光度準確度確認，也可依規定條件下的特徵光譜位置進行波長確認，不宜將用途絕對限縮為吸光度校正。 硝酸鈷銨可作為比色計的光度校正材料，應列入可用的校正物質。 NADH 溶液常用於生化反應的光度測定，並非本單元所採用的波長校正標準。 氯化鈉不是一般比色計波長或吸光度校正所用的標準物質。 校正用途不必互斥。判斷時應看材料是否具有適合該項校正的已知特性，而不是將所有材料硬分成只能校正波長或只能校正吸光度兩組。 二、NADH 的吸收與波長校正不可混為一談 NADH 在 340 nm 有重要吸收，常利用反應前後吸光度的變化追蹤酵素反應。知道它的量測波長，不代表它就是波長校正標準。 波長校正需要適合定位、具有可靠參考位置的光譜特徵。不能只憑「某物質在某波長會吸光」就認定可用於校正，也不能單以「吸光度受濃度影響」作為排除理由，因為許多標準溶液的吸光度同樣與濃度有關。 三、最適吸光度與光度誤差 比爾－朗伯定律為 A＝εbc，其中 A 為吸光度、ε 為莫耳吸光係數、b 為光程、c 為濃度。在適用條件內，吸光度與濃度成正比。吸光度與透光率的關係為 A＝－log₁₀T，此處 T 以小數表示。 吸光度太低：樣品透光量與空白差異很小，吸收訊號不易與背景、讀值波動及空白誤差區分，因此濃度的相對誤差較大。 吸光度太高：透射光很少，偵測器雜訊及雜散光的影響變得明顯。雜散光會使測得透光率偏高，導致吸光度偏低，並造成偏離線性。 吸光度適中：一般可將約 0.2～0.8 視為實用範圍；實際可接受範圍仍依儀器與方法而定。 比較不同吸光度時，0.25 屬於適中的量測區間；接近零的吸光度訊號太小，而達到 2.5 時透光量已很低。不要因吸光度數值較大就判定較準確，也不要以吸收波長是 420 nm 推論吸光度應取何值。 若假設透光率的絕對誤差固定，理論上最低相對濃度誤差出現在吸光度約 0.434；這是特定誤差模型下的結果，不代表所有儀器都只有這個吸光度才準確。 四、分析物本身的特徵吸收波長 分析物應掌握的吸收特徵 卟啉（porphyrin）約 400 nm 附近有強烈的 Soret 帶，是重要的特徵配對；確切峰位可隨卟啉種類及環境改變。 尿酸（uric acid）直接紫外吸收測定常利用約 293 nm 的吸收，因此不應將 360 nm 背成尿酸的典型特徵波長。 未結合膽紅素在約 450 nm 附近有重要吸收，峰位會受溶劑及蛋白質結合等條件影響；560 nm 不是其典型直接吸收配對。 糖化血色素 HbA1c檢測可採分離、免疫或酵素等不同原理，不能將 480 nm 視為所有 HbA1c 方法共通的特徵波長。 直接測分析物與測反應產物，波長可能不同。例如尿酸可用直接紫外法，也可經酵素反應產生有色產物後測量；膽紅素本身的吸收與呈色反應產物的吸收也應分開記憶。遇到特徵波長配對，先判斷描述的是物質本身，還是某種檢驗方法。 五、常用臨床生化分析技術 技術原理與用途 分光光度法測量特定波長的光被吸收的程度，常用於分析物濃度及酵素活性測定。 螢光法測量物質受激發後放出的螢光，常用於具天然螢光或使用螢光標記的分析。 離子選擇性電極利用選擇性膜產生的電位差反映離子活性，常用於鈉、鉀、氯及游離鈣等測定。 圓偏光二色性測量物質對左、右圓偏極化光吸收的差異，主要用於蛋白質構形與手性研究，非常規臨床生化常用技術。 常考陷阱 「重鉻酸鉀只能校正吸光度，不能確認波長」：過度絕對化。它也可依規定條件下的光譜特徵用於波長確認。 「NADH 在 340 nm 吸光，所以可作波長校正標準」：將分析用途誤當校正用途；本單元應排除 NADH。 「透明、容易配製的氯化鈉溶液適合校正」：校正需要已知且適用的光學特性，成分單純並不足以成立。 「低吸光度主要怕雜散光，高吸光度愈高愈準」：低吸光度主要是訊號相對誤差大；高吸光度則須特別注意低透光量與雜散光。 「分析物名稱相同，所有方法就使用同一波長」：須區分直接吸收、反應產物及平台設計；卟啉約 400 nm 是應優先掌握的特徵配對。 「研究生物分子的儀器都是常規生化檢驗技術」：圓偏光二色性雖與生化研究相關，仍非常規臨床生化常用方法。 記憶口訣 「鈥、鏡、汞燈定波長；鉻可兼用，鈷校光。」鏡指 Didymium 濾光鏡，鉻指重鉻酸鉀，鈷指硝酸鈷銨。 「吸光適中較可靠；卟啉四百記得牢。」