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學習重點 散射比濁法（nephelometry）直接測量顆粒造成的散射光；濁度法（turbidimetry）則測量光束通過混濁樣品後，透射光減少的程度。 散射比濁法最常用於免疫分析。測定特定蛋白質時，加入對應抗體，使其形成可產生散射訊號的免疫複合物，例如補體 C3 的定量。 散射光接收器設於與入射光具有一定夾角的位置，不必與光源位於同一直線；散射比濁法的敏感度一般比濁度法高。 濁度測定若考較高特異性的波長範圍，應掌握660～700 nm；但脂血顆粒仍會散射光，造成干擾。 沉澱量取決於抗原與抗體的比例，等價帶附近、抗體略多於抗原時沉澱最多；抗原過量可能使測定結果偏低。 核心觀念 一、散射比濁法測量的是散射光 光束照射溶液中的懸浮顆粒時，部分光線會偏離原來的行進方向，向其他方向傳播，稱為散射。散射比濁法利用接收器量測這些散射光，並在適當的分析範圍內，透過校正曲線換算待測物濃度。 影響散射訊號的因素包括顆粒數量、大小、反應條件與儀器配置。因此，不能將「散射越強，濃度越高」無限制地套用到所有濃度；只有在方法已建立的有效測量範圍內，才可依訊號定量。 此法需要外來光源照射，偵測的是入射光受到顆粒作用後產生的散射光，不是螢光，也不是化學發光。反射、折射與吸收也不是散射比濁法的主要測量原理。 二、特定蛋白質的測定與臨床應用 若要測量溶液中的特定蛋白質 A，最適當的處理是加入蛋白質 A 的抗體。待測蛋白質作為抗原，與對應抗體結合並形成免疫複合物，再以其造成的散射訊號進行定量。辨識特定蛋白質的能力，主要來自抗原與抗體反應的專一性。 讓蛋白質變性並非必要步驟，且可能改變抗原決定位；濃縮與透析也不能取代對應抗體。Coomassie blue則是利用染料與蛋白質結合後的顏色及吸收變化進行分析，不能當作免疫散射比濁的核心試劑。 散射比濁法最常應用於免疫分析，常見測定對象包括免疫球蛋白、補體等蛋白質。C3 是補體成分，可加入抗 C3 抗體形成免疫複合物後測定。相較之下，鉛、葡萄糖與尿酸並非此類免疫散射比濁的典型測定項目。 三、散射比濁法與濁度法的比較 比較項目散射比濁法（nephelometry）濁度法（turbidimetry） 直接測量的訊號顆粒產生的散射光強度穿過樣品後的透射光強度 判讀依據顆粒形成造成散射訊號改變混濁使透射光減少，表觀吸光度增加 接收器位置與入射光形成一定夾角，接收散射光沿入射光的前進方向，接收透射光 一般敏感度通常較高，適合較低濃度的分析通常較低 共同基礎利用顆粒與光的交互作用利用顆粒與光的交互作用 濁度法雖可用「吸光度」形式表示結果，但此處光線減弱的重要原因是顆粒使光散射而離開原光路，不能一概理解為待測物真正吸收光能。中文名稱有時都簡稱「比濁法」，作答時應先確認英文是 nephelometry 或 turbidimetry。 四、接收器位置與測量方式 散射比濁儀的接收器可採光電倍增管（PMT）等光偵測元件。配置重點是接收偏離入射方向的散射光，常見配置為與入射光呈直角，也可採其他散射角度。因此，「PMT 接收器必須與光源在同一直線」是錯誤敘述；也不宜反過來認定所有儀器都只能採直角配置。 量測可採終點法（end point），於規定反應時間或適當終點讀取散射訊號；也可採動力學法（kinetic），觀察一段時間內散射訊號的變化或變化速率。兩者均可用於散射比濁分析，差異在於取用反應訊號的方式。 五、波長選擇與脂血干擾 濁度測定若比較不同波長範圍的特異性，應掌握660～700 nm 的紅光範圍。使用較長波長，可減少部分樣品成分本身吸收光線所造成的影響，使濁度造成的光強度變化較容易辨識。 此處的「較高特異性」是指測量濁度時較能減少其他吸收的干擾，並非指紅光能辨認某一種蛋白質，也不代表所有散射比濁儀都必須使用相同波長。波長選擇與抗體的免疫專一性，是不同層次的概念。 脂血（lipemia）會影響散射比濁結果，因為檢體中的脂質顆粒本身也能散射光，增加背景訊號或干擾判讀。不能因為使用長波長，或採用專一性抗體，就認為脂血完全沒有影響；處理時應依檢驗方法的規範進行。 六、抗原抗體比例、等價帶與抗原過量 抗原與抗體形成沉澱，需透過多個結合位置相互交聯，形成較大的網狀免疫複合物。當兩者比例適當、接近等價帶時，最有利於大型網狀結構形成，沉澱量最大。等價帶不是指抗原與抗體的分子數或重量必須相等。 反應區域抗原抗體比例與沉澱特性 抗體過量區抗體甚多於抗原，不利於形成最大的交聯網，沉澱較少。 等價帶附近比例適當，交聯充分，沉澱最多；比例選項中應掌握抗體略多於抗原。 抗原過量區抗原甚多於抗體，較易形成小型、可溶性的複合物，沉澱及散射訊號可能減少。 定量待測抗原時，通常加入規定量的對應抗體，並在經校正、可有效定量的反應範圍內測量，不應把抗原過量當成追求的測定條件。抗原過量可能使高濃度檢體反而出現偏低訊號，造成濃度低估；必要時須依方法規範稀釋重測或進行抗原過量檢查。 常考陷阱 「偵測抗原抗體反應產生的螢光」：錯在訊號種類；散射比濁測散射光。 「只能採終點法」：終點法與動力學法都可使用。 「接收器必須與光源共線」：散射比濁接收偏離入射方向的光；沿原光路測透射光是濁度法的配置重點。 「短波長散射較強，所以濁度測定特異性一定最高」：散射強度與測量特異性不可混為一談；較高特異性的波長範圍掌握 660～700 nm。 「抗體越多，沉澱越多」：略多與甚多不同；等價帶附近沉澱最多，大幅過量反而不利。 「散射訊號低就代表蛋白質濃度低」：須留意抗原過量可能造成結果偏低。 「抗體專一，所以不受脂血影響」：抗體能辨識抗原，脂質顆粒仍可造成光學干擾。 記憶口訣 「散射看側光，濁度看透光；測蛋白加抗體，補體 C3 要記牢；紅光六六到七百，抗體略多沉澱高；抗原過量會低估，脂血干擾別忘掉。」