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學習重點 點突變與等位基因分型：ARMS、SSCP、ASO 可用於脂蛋白元 E2 同合子的檢測；一般 FISH 不適合辨認單一核苷酸差異。 PCR-RFLP 標準順序：先 PCR 擴增，再限制酶切割，最後以瓊脂膠電泳判讀；膠中純化 DNA 並非必要步驟。 依放大對象區分技術：PCR 屬目標核酸放大，LCR 屬探針放大；Southern blot 與 Northern blot 屬未放大探針技術。 分清微陣列的檢測目的：雙色 cDNA 微陣列比較基因表現，紅、綠訊號皆強且相近時呈黃色；aCGH 比較基因組 DNA 拷貝數，主要偵測 CNV。 核心觀念 一、SNP、點突變與 ApoE 等位基因分型 單核苷酸變異（SNV）指 DNA 序列中單一核苷酸位置的變異；單核苷酸多型性（SNP）強調族群中的單核苷酸多型現象。點突變通常指單一核苷酸的改變，本單元重點是利用序列差異辨認等位基因。 脂蛋白元 E（ApoE）的不同等位基因可透過特定核苷酸差異加以區分。E2 同合子表示兩個等位基因均為 E2；判讀時應確認分型結果，而非僅看到 E2 訊號就認定為同合子。 技術原理與判讀重點 ARMSamplification refractory mutation system等位基因專一性 PCR。利用引子 3′ 端對目標鹼基的配對差異，使相符序列較易擴增。配合不同等位基因反應與控制，可進行分型。 SSCPsingle-strand conformation polymorphism將 DNA 變性為單股，在非變性電泳條件下，利用序列差異造成的構形與移動速率差異進行分析。可篩檢點突變，配合已知型別可協助分型，但不能單憑異常條帶直接得知確切序列。 ASO 雜交allele-specific oligonucleotide以等位基因專一性寡核苷酸探針辨認目標。適當的嚴格雜交條件可區分完全互補與單一鹼基錯配，適合檢測已知變異。 FISHfluorescence in situ hybridization利用螢光探針在細胞或染色體上定位核酸序列，常用於染色體數目及特定區域缺失、重複或重排分析。一般 FISH 不適合區分 ApoE 等位基因的單一鹼基差異。 選擇方法時，應先辨認欲測的是鹼基序列差異，還是染色體區域的位置與數量變化。使用螢光探針並不代表能辨認所有尺度的變異。 二、PCR-RFLP 的原理與操作順序 PCR-RFLP結合聚合酶鏈反應與限制酶片段長度多型性分析。當序列變異使限制酶辨識位點產生或消失時，切割後的 DNA 片段長度便可能不同。 PCR 擴增：增加含待測位點的目標 DNA。 限制酶處理：以適當限制酶切割 PCR 產物。 瓊脂膠電泳：分離不同長度的 DNA 片段，依條帶型態判讀基因型。 若一種等位基因可被切開、另一種不能，同合子與異合子便可能呈現不同條帶組合。異合子可同時出現兩種等位基因的片段型態，但實際可見條帶仍受片段大小、重疊及膠體解析度影響。 從膠中純化 DNA通常供定序、選殖等後續用途，並非 PCR-RFLP 判讀的必要步驟。另須注意，並非所有 SNP 都會改變天然限制酶切位，使用此法前須有合適的切割差異或實驗設計。 三、核酸探針技術：看清楚放大的對象 核酸探針依互補配對辨認目標序列；技術分類的關鍵是增加目標核酸、增加探針產物，或直接雜交偵測。 分類代表方法核心原理 Target amplification目標核酸放大PCR、ARMS增加待測目標序列的拷貝數；ARMS 是具等位基因選擇性的 PCR。 Probe amplification探針放大LCR，連接酶鏈反應相鄰探針與目標正確配對後，由連接酶接合；接合產物再作為後續反應模板，累積探針產物。 Unamplified probe technique未放大探針技術Southern blot、Northern blot以標記探針與膜上目標核酸雜交，方法本身不進行目標核酸或探針的鏈式擴增。 Southern blot 偵測 DNA，Northern blot 偵測 RNA。兩者皆涉及核酸分離、轉漬至膜及探針雜交。Northern blot 可觀察特定 RNA 的大小與相對含量，但偵測 RNA 不等於放大 RNA，因此不能歸為 target amplification。 LCR 的重點是探針連接與接合產物的累積，不可與 PCR 的聚合酶延伸機制混淆；「探針放大」也不宜只含糊記成螢光變亮。 四、雙色 cDNA 微陣列的顏色判讀 雙色基因表現微陣列可將兩組 RNA 分別製成 cDNA，標記不同螢光後與晶片探針雜交。當實驗組標紅色、對照組標綠色時，顏色意義如下： 觀察結果表現量意義 偏紅實驗組表現量相對較高。 偏綠對照組表現量相對較高。 明亮黃色兩組皆有強訊號，且表現量相近。 暗色或接近黑色兩組皆低表現，或訊號低於可辨識範圍。 色調主要反映兩組的相對比例，亮度則與訊號強度有關。因此，「兩組皆大量表現且無明顯差異」應判為黃色，不能因為兩組相等就判為黑色。 五、aCGH：比較 DNA 拷貝數 aCGH（array comparative genomic hybridization）以待測與參考的基因組 DNA進行差異螢光標記，再與晶片探針雜交，依正規化後的訊號比值評估染色體區域的相對拷貝數。 若比值定義為待測／參考，接近基準代表相對拷貝數相近；一段區域中連續探針的比值一致升高或降低，可能提示拷貝數增加或缺失。若圖採相反比值，方向也會相反，應先確認座標與標示。 aCGH 主要偵測拷貝數變異（CNV），可偵測範圍受探針密度與平台解析度影響。它不直接讀取鹼基序列，因此不能把訊號偏移解釋成許多點突變，也不是一般 SNV 檢測方法。沒有拷貝數改變的平衡性重排通常也無法由一般 aCGH 辨認。 判讀須區分背景雜訊與具有連續性、超出基準範圍的變化；不能只因某區域起伏不大，就認定是背景並忽略。 常考陷阱 「FISH 可辨認 ApoE2 同合子」：一般 FISH 適合染色體層級分析；ARMS、SSCP、ASO 才是本單元適用的序列差異檢測方法。 「先限制酶切割，再 PCR」：PCR-RFLP 的標準流程為先擴增、再切割、後電泳；膠中純化不在必要流程內。 「Northern blot 屬目標放大」：Northern 偵測 RNA，但本身不擴增目標；PCR 才屬 target amplification。 「LCR 放大目標 DNA」：LCR 在此分類屬 probe amplification，重點是探針的連接與累積。 「紅綠都強會呈白色」：本單元雙色微陣列的紅、綠訊號疊合呈黃色。 「aCGH 常用來測 SNV」：aCGH 看相對拷貝數；連續區域訊號偏移可提示 CNV，不能直接推論點突變。 記憶口訣 點突變：「ARMS 看引子、SSCP 看構形、ASO 看互補。」 PCR-RFLP：「先增、再切、後跑膠。」 探針分類：「PCR 增目標，LCR 增探針；南看 DNA，北看 RNA。」 微陣列：「紅綠都強呈黃色；表現看 cDNA，份數看 aCGH。」