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學習重點 葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOx）對β-D-glucose具有高度立體專一性；變旋酶（mutarotase）可加速 α、β 型互相轉換，縮短測定時間。 GOx 反應消耗氧，產生過氧化氫（H2O2）；葡萄糖先形成葡萄糖酸內酯，再水解為葡萄糖酸。 GOx／過氧化酶呈色法以過氧化酶（peroxidase，POD）為偶合酵素，使 o-Dianisidine 等呈色劑氧化顯色。 呈色法中，維生素 C、尿酸等還原性物質常造成假性偏低；能直接氧化呈色劑的物質可能造成假性偏高。 須區分呈色法與氧電極法；GOx 法也不可誤認為 IFCC 定量血漿葡萄糖的參考法。 核心觀念 一、立體專一性與變旋酶 GOx 直接作用的葡萄糖型式是β-D-glucose，不是 α-D-glucose，也不是 α-L-glucose 或 β-L-glucose。辨認時必須同時看清楚β 型與 D 型，只記「D-glucose」仍不夠精確。 水溶液中的 α-D-glucose 與 β-D-glucose 可經開鏈及閉鏈過程互相轉換，稱為變旋作用。當 β 型被 GOx 消耗時，α 型可繼續轉為 β 型，因此酵素對 β 型具有專一性，並不表示整個方法永遠只能測到檢體原有的 β 型葡萄糖。 加入mutarotase（變旋酶）可加速 α-D-glucose 與 β-D-glucose 的轉換，使葡萄糖較快完成反應。它的功能是加速變旋，並非直接氧化葡萄糖，也不會改變 GOx 本身的立體專一性。 二、葡萄糖氧化酶反應的受質與產物 GOx 催化的主要反應為： β-D-glucose＋O2 → D-glucono-δ-lactone＋H2O2 生成的葡萄糖酸內酯再經水解形成葡萄糖酸（gluconic acid），因此合併後可表示為： 葡萄糖＋O2＋H2O → 葡萄糖酸＋H2O2 判斷反應方向時，應掌握氧被消耗，過氧化氫被生成。水參與內酯的水解，不能把 GOx 這一步的產物簡單記成「葡萄糖酸與水」而漏掉 H2O2。 GOx 不以 NAD+ 為此反應的輔酶，也不產生 NADH、ATP 或葡萄糖六磷酸。因此，不能直接以 NADH 在 340 nm 的吸光度增加作為 GOx 反應的測量原理。 三、GOx／過氧化酶呈色法 此法以兩段反應完成測定：先由 GOx 將葡萄糖氧化並產生 H2O2，再由過氧化酶利用 H2O2 氧化呈色劑，形成有色產物。H2O2 是連接兩段反應的中間產物。 o-Dianisidine可作為偵測 H2O2 的呈色劑；其還原型可視為無色，經氧化後形成有色的 oxidized o-Dianisidine。在反應條件適當且無明顯干擾時，葡萄糖愈多，產生的 H2O2 愈多，呈色愈深，吸光度也愈高。 呈色劑原本是還原型物質，在反應中被氧化而顯色。這與檢體中的「還原性干擾物」角色不同：前者是設計好的訊號來源，後者可能競爭消耗 H2O2，或使有色產物被還原，造成訊號減弱。 Benedict’s reagent 用於還原糖反應，並非此法偵測 H2O2 的呈色劑；sodium nitroprusside 也不是這套葡萄糖呈色反應的標準試劑。 四、呈色法與氧電極法的區別 比較項目GOx／POD 呈色法GOx 氧電極法 共同反應GOx 氧化葡萄糖並消耗氧GOx 氧化葡萄糖並消耗氧 測量訊號有色產物的吸光度氧濃度或氧消耗的變化 搭配酵素過氧化酶（peroxidase）可搭配觸酶（catalase） H2O2 的處理用於氧化呈色劑搭配觸酶時，由觸酶分解 觸酶催化2 H2O2 → 2 H2O＋O2，因此會影響整個系統的淨氧消耗。氧電極法的核心仍是 GOx 所造成的氧變化，不能將它與 POD 催化的顏色變化混為一談。辨認酵素組合時，應記住呈色配過氧化酶，氧電極可配觸酶。 五、干擾物與偏差方向 干擾物主要影響測值方向 維生素 C（抗壞血酸）還原作用使 H2O2 或呈色訊號減少假性偏低 過高的尿酸干擾過氧化氫參與的呈色反應假性偏低 能氧化呈色劑的氧化性物質產生額外顏色，使訊號增加可能假性偏高 干擾方向要從顏色變深或變淡判斷。還原性干擾物通常使顏色變淡，因此不是造成偏高；能直接氧化呈色劑的物質則可能使顏色加深，產生偏高結果。上述方向主要針對 GOx／POD 呈色系統，不宜不加區分地套用到所有葡萄糖測定法。 六、適用檢體與參考法定位 GOx／POD 法可依試劑與儀器的適用範圍，用於血漿、血清、腦脊髓液等檢體；毛細血管血則須使用適合該檢體的測定系統，不能直接當作透明液體進行一般吸光度測量。 尿液較不建議直接採用一般 GOx／POD 呈色系統測定，重點在於尿中還原性物質及其他基質干擾可能影響呈色。GOx 對葡萄糖具有專一性，不代表後續呈色步驟也能免除所有干擾；也不能據此推論所有尿糖專用試片都不適用。 GOx 法是常見的葡萄糖測定方法，但「GOx 法為 IFCC 定量血漿葡萄糖的參考法」並不正確。應與己糖激酶偶合葡萄糖六磷酸脫氫酶的測定系統區分。 常考陷阱 「只對 α-D-glucose 作用」：錯在 α 型；應選 β-D-glucose。L 型也不符合其專一性。 「變旋酶使 GOx 可以直接氧化 α 型」：變旋酶是先加速 α、β 型轉換，GOx 仍作用於 β 型。 「氧是生成物」：GOx 反應消耗氧，生成 H2O2；觸酶分解 H2O2 才會釋出氧。 「生成 NADH、ATP 或葡萄糖六磷酸」：這些不是 GOx 反應的產物；直接測 340 nm 也不是此法的核心。 「偶合酵素是己糖激酶」：GOx 呈色法常搭配過氧化酶；與氧電極及觸酶的組合須分開記。 「還原物質使血糖偏高」：通常相反；維生素 C、尿酸會使呈色減弱而偏低。氧化性物質若直接使呈色劑氧化，才可能造成偏高。 「酵素專一，所以尿液沒有干擾」：酵素辨識葡萄糖的專一性，與後續呈色是否受到干擾，是兩個不同層次。 記憶口訣 「β-D 才反應，變旋加速換；耗氧生雙氧，過氧酶顯色；維 C 尿酸低，氧化顯色高。」