阿摩線上測驗
登入
阿摩線上測驗
登入
學習重點 分清三種測定法的訊號：葡萄糖氧化酶法先產生H2O2，再以Trinder反應呈色；以NAD+為輔酶的葡萄糖去氫酶法產生NADH；hexokinase／G6PD法則測量NADPH。 掌握Trinder呈色組合：H2O2、辣根過氧化酶、4-aminoantipyrine（4-AAP）與酚共同參與，形成紅色醌亞胺類產物，通常在約500～520 nm測定。 依方法判斷干擾：尿酸、抗壞血酸容易干擾葡萄糖氧化酶／過氧化酶呈色；hexokinase法須注意高濃度血紅素造成的測量誤差。 區分保存劑與抗凝血劑：碘乙酸與氟化物抑制糖解，減少採血後葡萄糖被消耗；草酸鹽主要負責抗凝血。 核心觀念 一、採血後的糖解與檢體保存 血液離開體內後，血球仍可進行糖解，持續消耗葡萄糖。若延遲分離血球或處理不當，測得的葡萄糖濃度可能低於採血當時的濃度。因此，血糖檢體須注意及時處理，並依檢驗方法選用合適的採血管。 Sodium iodoacetate（碘乙酸鈉）：可與酵素的重要硫氫基反應，抑制甘油醛-3-磷酸去氫酶（GAPDH），阻斷糖解。其作為血液保存劑的主要目的，是抑制糖解反應。 氟化物（fluoride）：抑制烯醇化酶，使2-磷酸甘油酸轉變為磷酸烯醇式丙酮酸的步驟受阻。氟化物對採血後早期糖解的抑制並非立即完成，不能取代及時處理檢體。 草酸鹽（oxalate）：藉由與鈣離子形成難溶性鹽而抗凝血。fluoride／oxalate管中的兩種成分各有功能：氟化物抑制糖解，草酸鹽抗凝血。 二、葡萄糖氧化酶與Trinder呈色 葡萄糖氧化酶／過氧化酶法分成「產生過氧化氫」與「利用過氧化氫呈色」兩個階段： 葡萄糖氧化酶反應：葡萄糖與氧氣反應，生成葡萄糖酸內酯及過氧化氫（H2O2）；葡萄糖酸內酯可再水解為葡萄糖酸。 Trinder呈色反應：在辣根過氧化酶（HRP）催化下，H2O2促使4-AAP與酚氧化偶合，形成紅色醌亞胺類產物。 在適當反應條件與測量範圍內，葡萄糖越多，生成的H2O2越多，最終紅色產物的吸光度也越高。此類4-AAP／酚呈色通常在約500～520 nm讀取，實際波長依試劑設定；410 nm不是此典型呈色系統的測量波長。 Trinder反應所需的關鍵物質是H2O2。普通水H2O、ATP或NADP都不能取代H2O2，啟動這套氧化呈色反應。 三、4-AAP的角色與應用範圍 4-AAP是呈色受質，也是過氧化酶催化反應的受質之一；它本身不是酵素。在典型Trinder系統中，4-AAP須搭配酚、H2O2與過氧化酶，才能形成可測量的紅色產物。 這套呈色系統可接在不同的上游酵素反應之後，用來測定葡萄糖、膽固醇、三酸甘油酯及尿酸等物質。其共通原理是：先讓待測物經反應產生H2O2，再由Trinder反應把H2O2的量轉換成顏色深淺。 「需加入酚」適用於此處的典型4-AAP／酚系統；其他改良試劑可能使用酚類衍生物或其他偶合劑，因此實務上仍應依試劑組成判讀。 四、尿酸與抗壞血酸的干擾 尿酸與抗壞血酸具有還原性，可能消耗H2O2或干擾氧化呈色，使顏色形成不足，造成葡萄糖結果偏低。判斷干擾時，重點是測定法是否依賴H2O2／過氧化酶呈色。 尿液含有尿酸，因此葡萄糖氧化酶／過氧化酶法容易受到尿酸干擾，不適合直接作為尿糖定量方法。這項限制針對此呈色系統，不能擴大解讀為所有葡萄糖酵素法都同樣受影響。 尿酸也能作為其他檢驗項目的待測物，並不矛盾：測尿酸時，是先以尿酸酶使尿酸反應並產生H2O2；測葡萄糖時，檢體中的尿酸則可能成為干擾物。 五、葡萄糖去氫酶法 以NAD+為輔酶的葡萄糖去氫酶（glucose dehydrogenase，GDH）反應可表示為： 葡萄糖＋NAD+ → 葡萄糖酸內酯＋NADH＋H+ 此法利用生成的NADH在340 nm的吸光度定量葡萄糖。辨識產物時應記住：NADH是還原型輔酶；葡萄糖-6-磷酸、葡萄糖醛酸及H2O2都不是上述反應的產物。 GDH有不同輔酶類型，不能把所有GDH方法都視為產生NADH；此處討論的是NAD+依賴型GDH。此法不依賴Trinder呈色，因此沒有相同的尿酸消耗H2O2干擾途徑。 六、Hexokinase／G6PD法與血紅素干擾 Hexokinase法包含兩個連續反應： Hexokinase：葡萄糖＋ATP → 葡萄糖-6-磷酸＋ADP。 G6PD：葡萄糖-6-磷酸與NADP+反應，生成6-磷酸葡萄糖酸內酯與NADPH；內酯可再水解為6-磷酸葡萄糖酸。 測量NADPH在340 nm的吸光度變化，即可換算葡萄糖濃度。此法不依賴過氧化酶呈色，通常較少受到抗壞血酸等還原性物質的影響。 在此法的典型干擾判讀中，應辨識血紅素濃度大於0.5 g/dL可能造成誤差，主要須注意血紅素的光學干擾；不可一律認定結果只會偏高或偏低。實際干擾程度仍依試劑與儀器而異。 含fluoride／oxalate或iodoacetate的採血管，不應僅因具有糖解抑制作用，就被判定必然干擾hexokinase測定。抑制檢體內糖解與干擾分析反應，是兩件不同的事。 七、易混淆方法比較 方法關鍵產物或作用判讀重點 葡萄糖氧化酶／Trinder法先產H2O2，再形成紅色產物約500～520 nm；注意尿酸、抗壞血酸干擾 NAD+依賴型GDH法NADH340 nm；不產生H2O2 Hexokinase／G6PD法NADPH340 nm；注意高濃度血紅素干擾 Mutarotase促進α、β型葡萄糖互相轉換可作為輔助酵素，本身不直接產生定量所需的顏色訊號 常考陷阱 「碘乙酸主要抑制蛋白質或脂肪分解」：血糖檢體保存的判斷關鍵是抑制糖解，主要作用點為GAPDH。 「氟化物阻止磷酸烯醇式丙酮酸形成2-磷酸甘油酸」：糖解方向應是2-磷酸甘油酸轉為磷酸烯醇式丙酮酸，勿把方向記反。 「4-AAP是過氧化酶」或「在410 nm測定」：4-AAP是呈色受質；典型紅色產物在約500 nm附近測量。 「加入水、ATP或NADP即可使Trinder試劑變紅」：須有H2O2參與，才能形成紅色產物。 「尿酸會同樣干擾所有葡萄糖測定法」：優先辨識依賴H2O2／過氧化酶呈色的方法。 「GDH產生H2O2，hexokinase法產生NADH」：應分別記為NAD+依賴型GDH產生NADH，典型hexokinase／G6PD法產生NADPH。 「抑制糖解的採血管必然使hexokinase結果失準」：不能直接如此推論；在相關比較中，高濃度血紅素才是應辨識的干擾因素。 記憶口訣 保存：「氟停烯醇，碘鎖GAPDH；草酸抓鈣防凝血。」 呈色：「過氧、過氧酶，四安加酚紅色現；五百附近看吸光。」 產物：「氧化酶產過氧，去氫酶看NADH；己糖激酶接G6PD，看NADPH。」