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學習重點 掌握雙縮脲法的三個關鍵：鹼性環境、二價銅離子 Cu²⁺、胜肽鍵，反應形成藍紫色複合物，以比色法定量總蛋白。 分清反應名稱、試劑與標準品：試劑不含 biuret 作為必要成分，蛋白質定量也不以 biuret 作標準品。 熟記試劑功能與結構要求：酒石酸鹽防止銅沉澱，碘化鉀作為抗氧化及穩定成分；典型反應至少需要兩個胜肽鍵。 會用總蛋白－白蛋白＝球蛋白及白蛋白÷球蛋白＝A/G 比值，並理解多發性骨髓瘤使比值下降的原因。 能辨認白蛋白染劑結合法、其他蛋白質定量法，以及肌酐、尿素與脂質檢驗方法。 核心觀念 一、雙縮脲法：以胜肽鍵與銅離子反應定量總蛋白 雙縮脲法（biuret method，又稱雙脲法）是臨床測定血清總蛋白的常用方法。在鹼性溶液中，蛋白質的胜肽鍵與Cu²⁺形成有色配位複合物，典型顏色為藍紫色。在適當測定範圍內，呈色吸光度與蛋白質濃度成正比，可與已知濃度的蛋白質標準液比較，求得總蛋白濃度。 本法測的是胜肽鍵所產生的呈色反應，不是直接測定含氮量，也不是利用折射、酸沉澱或藍色染劑結合來定量。所需金屬離子為二價銅，不能以鈣、鎂、鋅或錳離子替代作為反應原理的答案。 典型雙縮脲反應至少需要兩個胜肽鍵，因此一般以三胜肽以上才有反應。游離胺基酸沒有胜肽鍵，雙胜肽只有一個胜肽鍵，均不呈典型雙縮脲反應。注意「三個胺基酸」與「三個胜肽鍵」不同：三個胺基酸連成三胜肽時，只有兩個胜肽鍵。 二、雙縮脲試劑、名稱與標準品 成分主要功能 硫酸銅等銅鹽提供 Cu²⁺，與蛋白質胜肽鍵形成有色複合物。 氫氧化鈉或氫氧化鉀等鹼液提供反應所需的鹼性環境。 酒石酸鹽使銅維持可溶狀態，防止銅在鹼性溶液中沉澱。 碘化鉀作為抗氧化及穩定試劑的成分。 Biuret 是雙縮脲化合物的名稱；它與銅離子的呈色反應和蛋白質相似，因此成為方法名稱的來源。反應叫 biuret，不表示試劑要加入 biuret。也不能因為 biuret 能呈色，就把它當作臨床蛋白質定量的標準品；定量應使用已知濃度的蛋白質標準液。 雙縮脲法對不同蛋白質的反應主要取決於胜肽鍵。不能僅因小分子蛋白質增加，就判定蛋白質濃度一定被高估。小分子蛋白質仍可能含有許多胜肽鍵，不能與游離胺基酸、雙胜肽混為一談；分子量較小本身並非必然造成正偏差的理由。 三、白蛋白測定與球蛋白計算 白蛋白可用染劑結合法測定，常見染劑包括溴甲酚綠（BCG）及溴甲酚紫（BCP）。BCG 的關鍵原理是在酸性溶液中與白蛋白結合，產生顏色變化，再依吸光度定量。這與雙縮脲法的鹼性條件不同。 BCG 法具有良好的測定敏感性，是常見的白蛋白檢驗法；但其選擇性並非絕對，部分球蛋白也可能參與結合。因此，辨認檢驗原理時，應優先掌握「酸性、BCG、白蛋白結合」，不要延伸成完全沒有其他蛋白質干擾。 血清總蛋白主要由白蛋白與球蛋白構成。臨床常規報告中的球蛋白通常由下式計算，計算前兩項數值須採用相同單位： 球蛋白＝總蛋白－白蛋白A/G 比值＝白蛋白÷球蛋白＝白蛋白÷（總蛋白－白蛋白） 例如總蛋白為 7.0 g/dL、白蛋白為 4.0 g/dL，則球蛋白為 3.0 g/dL，A/G 比值約為 1.33。蛋白質電泳可分析蛋白分布，免疫分析可測定特定免疫球蛋白，但兩者都不是常規球蛋白總值的主要取得方式。 四、A/G 比值下降的意義 A/G 是白蛋白相對於球蛋白的比例。白蛋白減少或球蛋白增加，都可使 A/G 比值下降；比值降低不代表總蛋白一定降低，應同時查看白蛋白、球蛋白與總蛋白的數值。 多發性骨髓瘤可因單株免疫球蛋白大量增加，使球蛋白上升，因而造成 A/G 比值下降；即使總蛋白升高，A/G 仍可能降低。這是「球蛋白增加使分母變大」的典型例子。 脫水主要造成血液濃縮，使白蛋白與球蛋白濃度可能同時升高；若兩者等比例增加，A/G 比值大致不變。因此，不能只看到總蛋白升高或脫水，就推論 A/G 必然下降。 五、其他定量方法與檢驗項目的辨認 方法原理或測定項目辨認關鍵 Biuret 法鹼性條件下，Cu²⁺ 與胜肽鍵形成藍紫色複合物。血清或血漿總蛋白定量。 Folin-Ciocalteu 法利用 Folin 試劑被還原後的呈色反應測定蛋白質。屬蛋白質定量方法；Lowry 法結合銅反應與 Folin 呈色。 Kjeldahl 法經消化測氮，再換算蛋白質含量；須注意非蛋白氮的影響。屬測氮原理，勿與雙縮脲法混淆。 Friedewald 法利用脂質檢驗數值估算 LDL 膽固醇。不是蛋白質定量方法。 Jaffe 法肌酐與鹼性苦味酸鹽（picrate）反應呈色。測定肌酐，不是測蛋白質。 Fearon／二乙醯基單肟法以二乙醯基單肟（diacetylmonoxime，DAM）相關呈色反應測定尿素。測定尿素，不是測蛋白質。 常考陷阱 「雙縮脲反應在酸性或中性進行」：錯。應選鹼性；酸性染劑結合是 BCG 測白蛋白的辨認重點。 「雙縮脲產生黃色產物」：錯。典型呈色為藍紫色，且以吸光度定量。 「試劑含 biuret，並以 biuret 作標準品」：錯。方法名稱不等於試劑成分；標準品應為已知濃度的蛋白質。 「銅鹽與硫酸反應測出蛋白質含氮量」：錯。雙縮脲法的核心是 Cu²⁺ 與胜肽鍵配位；測氮換算蛋白質是 Kjeldahl 法的方向。 「酒石酸鹽是抗氧化劑」：功能錯置。酒石酸鹽重點在防止銅沉澱；碘化鉀則是抗氧化及穩定成分。 「雙胜肽已有兩個胜肽鍵」：錯。雙胜肽只有一個胜肽鍵；三胜肽才有兩個。 「小分子蛋白增加必使結果高估」：錯。不能只憑分子量推論測定偏差，也不能把小分子蛋白等同於游離胺基酸。 「球蛋白常規以染劑直接測得」：錯。通常以總蛋白減白蛋白計算；A/G 的分母是球蛋白，不是總蛋白。 「總蛋白升高，A/G 一定升高」：錯。多發性骨髓瘤可因球蛋白增加而出現總蛋白高、A/G 低。 記憶口訣 「銅、鹼、胜肽，呈藍紫；兩鍵三肽才顯色。酒石防沉，碘鉀抗氧；總減白得球，白除球得比。」 「BCG 酸中測白；骨髓瘤球增比降；Jaffe 肌酐、DAM 尿素、Friedewald 算血脂。」