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學習重點 約 220 nm 看胜肽鍵，280 nm 看芳香族側鏈。兩者都可作為蛋白質定量的依據，但偵測的結構不同。 280 nm 的主要吸光來源是酪胺酸與色胺酸。色胺酸吸光最強，苯丙胺酸的貢獻較弱，脯胺酸則幾乎沒有明顯吸收。 衍生物的判斷要先找出起始胺基酸。血清素來自色胺酸；多巴胺、甲狀腺素來自酪胺酸；組胺來自組胺酸。 血清白蛋白常用 BCG、BCP 色素結合法。白蛋白與染料結合後形成有色複合體，再進行比色測定。 例行測定與最高特異性要分清楚。一般血清白蛋白測定可選 BCG；比較白蛋白檢測的特異性時，免疫散射比濁法優於一般總蛋白質測定法。 核心觀念 一、蛋白質的紫外吸收：主鏈與側鏈不同 蛋白質的紫外吸收與分子結構有關。約 220 nm 的吸收主要反映主鏈中的胜肽鍵；280 nm 的吸收則主要反映側鏈中的酪胺酸與色胺酸，可用來估算蛋白質濃度。 波長主要偵測結構判讀重點 約 220 nm胜肽鍵看蛋白質或胜肽的主鏈結構。 280 nm芳香族胺基酸側鏈以酪胺酸、色胺酸的貢獻為主。 在其他條件固定時，吸光度可隨蛋白質濃度增加而上升；但不同蛋白質所含的酪胺酸、色胺酸比例不同，相同濃度的不同蛋白質，A280 不一定相同，因此不能將所有蛋白質都視為具有相同的吸光能力。 二、280 nm 吸光強弱與胺基酸分類 常見的三種芳香族胺基酸為苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸。若比較其在 280 nm 的吸光貢獻，可記為色胺酸最強、酪胺酸次之、苯丙胺酸很弱。苯丙胺酸的主要吸收位置並非 280 nm，因此不能把三者在此波長的貢獻視為相等。 胺基酸側鏈特徵280 nm 吸光重點 色胺酸 tryptophan吲哚環吸光最強，是主要貢獻者。 酪胺酸 tyrosine含酚基的芳香環有明顯吸收，是主要貢獻者。 苯丙胺酸 phenylalanine苯環屬芳香族，但在 280 nm 的吸收很弱。 脯胺酸 proline非芳香性的環狀結構幾乎沒有明顯吸收。 組胺酸 histidine咪唑環在 280 nm 沒有明顯吸收。 單一胺基酸的選擇須看比較對象：酪胺酸與白胺酸、甘胺酸、絲胺酸相比，應選酪胺酸；若問吸光最強，且選項有色胺酸，則選色胺酸。不能背成「只要問 280 nm，就一律選酪胺酸」。 此外，有環不等於在 280 nm 有強吸收。脯胺酸的環不具芳香性；組胺酸的咪唑環雖具芳香性，也不能因此推論其具有酪胺酸或色胺酸般的 280 nm 吸收。 三、胺基酸衍生物：先回推合成來源 若考的是衍生物之起始合成胺基酸的吸光性，應先找出其前驅物，再判斷前驅物在 280 nm 是否有明顯吸收。 衍生物起始胺基酸起始胺基酸的 280 nm 吸收 血清素 serotonin色胺酸明顯。 多巴胺 dopamine酪胺酸明顯。 甲狀腺素 thyroxine酪胺酸明顯。 組胺 histamine組胺酸無明顯吸收。 因此，辨識重點是組胺來自組胺酸，而非僅觀察衍生物名稱或最終分子的環狀結構。 四、280 nm 定量蛋白質的干擾 A280 偵測的是樣品在該波長的總吸收，無法自行辨識吸收來自蛋白質或其他物質。游離色胺酸、游離酪胺酸也會吸收 280 nm 紫外光，若將其吸收一併算成蛋白質，可能造成濃度高估；膽紅素也可能產生光學干擾。 在游離色胺酸、游離酪胺酸、葡萄糖與膽紅素之間，葡萄糖對此測量準確度的影響最小。判斷關鍵是物質在測定波長的吸收特性，不能單憑其在血中含量多寡決定。 五、白蛋白的直接吸收與色素結合法 白蛋白本身具有紫外吸收，可利用 UV 吸收進行測量；但不能僅靠 A280，在混合血清中專一辨識白蛋白。其他蛋白質及吸光物質也會貢獻訊號。純化白蛋白的紫外定量，與血清中白蛋白的選擇性測定，須分開理解。 白蛋白本身沒有可供例行直接可見光比色定量的明顯顏色。臨床常利用溴甲酚綠 bromocresol green，BCG或溴甲酚紫 bromocresol purple，BCP與白蛋白結合，形成有色複合體後測量吸光度。 在這些方法的測定條件下，白蛋白對染料具有較強的結合能力。BCG 比較白蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白與前白蛋白時，以白蛋白為主要結合對象；BCP 在 pH 5.2 時，也以白蛋白的結合能力最強。這不代表染料完全不與其他蛋白質反應。 六、白蛋白測定方法的用途與特異性 方法用途與判斷 BCG、BCP 色素結合法常用於血清白蛋白定量；若與 Biuret、Bradford、Lowry 比較例行白蛋白測定用途，選 BCG。 免疫散射比濁法 immunonephelometry以抗白蛋白抗體形成免疫複合體，測量散射光；在所比較的方法中特異性最高。 蛋白質電泳分離白蛋白與各類球蛋白，可估算白蛋白含量，但其辨識基礎不同於專一抗體。 Biuret 反應利用胜肽鍵的呈色反應測定總蛋白質，不能直接專一測定白蛋白。 Bradford、Lowry 法主要用於蛋白質定量，並非血清白蛋白的專一測定法。 酸沉澱法利用沉澱或溶解性差異，特異性不及免疫法。 常考陷阱 「280 nm 測胜肽鍵」：波長配錯；胜肽鍵選約 220 nm，280 nm 主要看芳香族側鏈。 「三種芳香族胺基酸在 280 nm 吸光一樣強」：色胺酸最強，酪胺酸次之，苯丙胺酸很弱。 「脯胺酸有環，所以吸光強」：脯胺酸的環不是芳香環，在 280 nm 幾乎沒有明顯吸收。 「衍生物有芳香環就能直接判斷」：若問起始胺基酸，須回推合成來源；組胺對應組胺酸。 「游離胺基酸不屬蛋白質，所以不干擾」：游離酪胺酸與色胺酸仍會增加 A280；所列物質中葡萄糖影響最小。 「白蛋白不能用 UV 測量」：白蛋白可吸收紫外光，限制在於血清混合物中的專一性。直接可見光測量則需先有適當呈色反應。 「最適合例行測定就是特異性最高」：例行血清白蛋白測定可選 BCG；比較特異性時選免疫散射比濁法。 記憶口訣 二二〇看胜肽，二八〇看酪色；色最強、苯較弱，脯無明顯吸收。血清素從色來，多巴甲狀從酪來；組胺從組來。白蛋白染綠紫，例行選 BCG；若比特異性，抗體免疫記心裡。