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學習重點 周邊血抹片鏡檢先以低倍定位，再轉高倍觀察。染色抹片屬明視野觀察，應將聚光器升高、光圈調大，使進光充足，細胞較易辨識與計數。 白血球分類計數與細胞形態判讀一般使用1000倍油鏡（100倍油浸物鏡）。400倍為乾燥物鏡，不需滴油，只適合掃描、找區域及估計白血球數量。 楔形抹片應觀察中後段，條件是紅血球呈單層分布、彼此不重疊，且可見中央淡染區（central pale area）。不要選頭端、尾端或兩側邊緣，也不要專找白血球最多的地方。 Romanowsky（Wright）染色偏紅橘的原因包括緩衝液偏酸、染色時間太短、沖洗太久。偏藍的原因包括pH太高、染色太久、沖洗不足、抹片太厚。 甲烯基藍是鹼性染劑，可染DNA、RNA及嗜鹼性球顆粒。白血球的初級顆粒（嗜天青顆粒）由azure染成紫紅色，甲烯基藍不染。 核心觀念 一、顯微鏡操作要點 觀察染色抹片時，先用低倍（10倍物鏡）瀏覽全片，確認染色品質與細胞分布，並找出適當的觀察區域。接著把該區移到視野中央，再轉換高倍。 染色後的細胞本身有顏色，對比已經足夠，因此應升高聚光器、把光圈調大，讓進光量充足，才能清楚辨識細胞核形態、細胞質顏色與顆粒。光圈調小的做法適用於觀察未染色標本，例如濕片，用來增加對比，不適用於染色抹片的分類計數。 倍率物鏡類型主要用途 100倍（10×10）乾燥物鏡瀏覽全片、評估染色與分布、選擇觀察區 400倍（40×10）乾燥物鏡，不需油掃描、粗估白血球數量、尋找異常細胞 1000倍（100×10）油浸物鏡，需滴油白血球分類計數、紅血球與血小板形態判讀 「400倍」與「油鏡」不能並存。一般的40倍物鏡是乾燥鏡，滴油反而會使影像模糊並污染鏡頭。油鏡指的是100倍物鏡。使用油鏡前，抹片必須完全乾燥。 二、白血球分類計數方法 分類計數應在紅血球呈單層的區域進行，以油鏡逐一視野移動，常用「城垛式（battlement）」移動路徑，避免重複計數或漏數同一區。將看到的白血球依序分類，一般計數100個，求出各類白血球的百分比（相對值）。若要計算絕對值，以白血球總數乘上該類百分比。 白血球在抹片上分布並不均勻。體積較大的細胞，例如單核球與嗜中性球，容易被推到尾端與兩側邊緣；淋巴球則較多分布在中央。只在白血球密集的區域計數，會造成分類比例偏差。 染色完成的抹片若保存得當，可以長期保存並重複鏡檢，沒有「須在1小時內觀察計數才正確」的規定。 三、楔形抹片的適當觀察區域 楔形抹片（wedge smear）由頭端到尾端逐漸變薄。最理想的觀察區在中後段，也就是接近尾端但尚未變形的位置。這裡的紅血球呈單層分布，彼此剛好相鄰或略微接觸，並可清楚看到中央淡染區，適合評估紅血球大小、形狀、色素，也適合白血球分類。 抹片部位特徵是否適合觀察 頭端（head）太厚，紅血球堆疊成錢串狀，細胞皺縮，看不清形態不適合 中後段紅血球單層、不重疊，可見中央淡染區最適合 尾端（feather edge）過薄，紅血球扁平、失去中央淡染區，可能變形或破裂；大型白血球聚集不適合形態判讀與分類，但可用來找血小板凝集或大型異常細胞 兩側邊緣（margin）大型白血球被推擠聚集，分布不均不適合作為計數區 四、Romanowsky（Wright）染色異常判讀 Wright染色屬Romanowsky類染色，成分有兩類： 酸性染劑eosin：染血紅素與嗜酸性球顆粒，呈紅橘色。 鹼性染劑methylene blue及其氧化產物azure B：染細胞核、細胞質RNA與嗜鹼性顆粒，呈藍紫色。 正常染色時，紅血球呈粉紅至橘紅色，細胞核呈紫色，嗜中性球顆粒呈淡紫色。染色條件偏離時，整體色調會偏紅或偏藍。 異常成因鏡下表現 過紅（偏酸）緩衝液pH太低、染色時間太短、沖洗太久、乾燥前塗膜未完全乾紅血球鮮紅橘色，細胞核淡、偏粉紅，白血球顆粒不清 過藍（偏鹼）緩衝液或染液pH太高、染色時間太長、沖洗不足、抹片太厚、緩衝液稀釋不足紅血球呈藍灰或綠灰色，嗜中性球顆粒過深，嗜酸性球顆粒偏灰藍 沖洗太久時，與細胞結合較弱的鹼性染料（藍色）會被洗掉，留下以eosin為主的紅色，因此紅血球呈過紅橘色。 五、甲烯基藍的染色特性 甲烯基藍是鹼性（陽離子）染劑，會與帶負電的酸性構造結合： DNA與RNA的磷酸基帶負電，可被染色。 嗜鹼性球顆粒含heparin等硫酸化酸性物質，可被染色。 白血球的初級顆粒（primary granules）又稱嗜天青顆粒（azurophilic granules），含myeloperoxidase等酵素，在骨髓母細胞、前骨髓細胞中最明顯。顧名思義，它們由azure（azure B）染成紫紅色，甲烯基藍本身並不染。 構造甲烯基藍說明 DNA可染核酸磷酸基帶負電 RNA可染細胞質嗜鹼性來源，網狀紅血球的網狀物亦屬之 嗜鹼性球顆粒可染含強酸性物質 初級（嗜天青）顆粒不染由azure染成紫紅色 常考陷阱 「400倍觀察計數，但必須使用油鏡」：錯誤。400倍是乾燥物鏡，不用油；需要用油的是1000倍（100倍物鏡）。 「染色後需1小時內觀察計數」：錯誤。染色抹片可以保存後再觀察，沒有此時限。 「觀察抹片頭端，找白血球最多的區域」：錯誤。頭端太厚、細胞重疊，而白血球多寡並不是選擇區域的依據。 「顯微鏡光圈需調高」：正確。染色抹片需要充足進光，不要與未染色濕片「光圈調小增加對比」的做法混淆。 「觀察頭端，細胞較完整」：錯誤。頭端細胞堆疊，形態反而看不清楚。 「觀察尾端，RBC呈單層且WBC多，方便一併計數」：錯誤。尾端紅血球過度扁平、失去中央淡染區，大型白血球也會聚集，造成分類偏差。 「觀察兩側margin，WBC較多計數較容易」：錯誤。邊緣的白血球分布不均，會高估大型細胞的比例。 判斷最佳區域只看「單層」不夠：還必須看得到中央淡染區。關鍵詞是「中後段＋單層＋central pale area」。 過紅橘色的成因：沖洗太久是答案。pH太高、染色太長、抹片太厚都會造成偏藍，方向相反。 甲烯基藍不染的構造：名稱中有「嗜鹼」的構造它都染，例如DNA、RNA、嗜鹼性顆粒。不染的是「嗜天青」的初級顆粒，由azure負責染色。 記憶口訣 「中後單層見淡染，頭厚尾薄邊不均」：楔形抹片選中後段，紅血球單層且見中央淡染區；頭端太厚，尾端太薄，邊緣分布不均。 「光圈開大、四百乾、一千滴油」：染色片的光圈要開大；400倍是乾燥鏡，1000倍才滴油。 「洗太久變紅，鹼久厚變藍」：沖洗過久（或偏酸、染太短）偏紅；pH高、染太久、抹片厚偏藍。 「甲藍染嗜鹼，天青歸azure」：甲烯基藍染核酸與嗜鹼性顆粒，嗜天青（初級）顆粒由azure染色。