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學習重點 分清吞噬細胞的趨化、調理與吞噬、呼吸爆發與氧化殺菌各步驟，以及促進各步驟的因子。 NADPH oxidase 以 NADPH 提供電子給 O₂，產生超氧陰離子（superoxide, O₂⁻）。它屬於氧依賴性、吞噬體內的殺菌，而且需要次級（特異）顆粒與吞噬體融合。 生成 ROS 的核心反應物是 O₂、NADPH、NADPH oxidase。peroxidase（MPO）位於下游，利用 H₂O₂ 產生次氯酸鹽（hypochlorite, OCl⁻）。 NETs 的活性成分是嗜中性球自身的 DNA 與組蛋白。 DCFH-DA 探針搭配流式細胞儀，用來測量細胞內的過氧化氫（H₂O₂）。 核心觀念 一、趨化與吞噬 趨化是吞噬細胞沿化學物質的濃度梯度移動到感染部位。典型趨化因子有 C5a、IL-8、LTB₄，以及細菌的 N-甲醯胜肽（fMLP）。吞噬是吞噬細胞辨識病原菌後伸出偽足，把病原菌包入吞噬體。 補體：活化的補體可提升吞噬作用。C3b、iC3b 是調理素，經補體受體被辨識；C5a 則是趨化因子。 抗體：IgG 經 Fcγ 受體產生調理作用，促進吞噬。抗原抗體複合物也能經古典路徑活化補體，產生 C5a，因此抗體可促進吞噬細胞的趨化作用，這是正確敘述。 細胞骨架（cytoskeleton）：肌動蛋白微絲與微管負責細胞移動、偽足形成與吞噬體移動，是趨化和吞噬都需要的重要分子。 H₂O₂：H₂O₂ 是吞噬之後呼吸爆發的產物，功能是氧化殺菌。它不能提升吞噬作用，過量時反而會傷害吞噬細胞本身。 二、NADPH oxidase 與呼吸爆發 吞噬後，嗜中性球的耗氧量急遽上升，稱為呼吸爆發（respiratory burst）。這屬於氧依賴性殺菌，反應如下： NADPH + 2O₂ —(NADPH oxidase)→ NADP⁺ + 2O₂⁻ + H⁺ 2O₂⁻ + 2H⁺ —(SOD)→ H₂O₂ + O₂ 成熟的顆粒性白血球殺菌時產生 superoxide，靠的是 NADPH oxidase。 NADPH oxidase 的膜成分是細胞色素 b558（gp91phox／p22phox），主要位於次級（特異）顆粒及分泌小泡的膜上。胞質成分有 p47phox、p67phox、p40phox 與 Rac。 吞噬後，次級顆粒與吞噬體融合，把細胞色素 b558 帶到吞噬體膜上，再與胞質成分組裝成活性酵素。因此 NADPH oxidase 的殺菌功能須經次級顆粒與吞噬體融合這一步。 產生的 O₂⁻、H₂O₂ 等活化氧集中在吞噬體內，屬於細胞內毒殺，而且與活化氧直接相關。 NADPH oxidase 先天缺陷會造成慢性肉芽腫病（CGD）。患者的吞噬細胞能吞進細菌，卻無法產生 O₂⁻，所以殺菌能力不足。 三、MPO 與次氯酸鹽 髓過氧化酶（myeloperoxidase, MPO）位於嗜中性球的嗜天青顆粒（azurophilic granules，即初級顆粒）。它在呼吸爆發的下游，利用已生成的 H₂O₂ 氧化氯離子： H₂O₂ + Cl⁻ + H⁺ —(MPO)→ HOCl + H₂O HOCl 在生理 pH 下部分解離為 OCl⁻（hypochlorite），是殺菌力最強的含氯氧化劑之一。MPO 催化產生的物質是 hypochlorite，不是 superoxide。 題目問「參與形成 ROS 的生化反應」時，答案指的是起始反應的 O₂、NADPH 與 NADPH oxidase。Peroxidase 是消耗 H₂O₂ 的下游酵素，不在此列。 酵素位置受質產物 NADPH oxidase次級顆粒膜 → 吞噬體膜O₂、NADPHO₂⁻（superoxide） SOD細胞質／吞噬體O₂⁻H₂O₂ MPO（peroxidase）嗜天青（初級）顆粒H₂O₂、Cl⁻HOCl／OCl⁻（hypochlorite） 四、嗜中性球細胞外捕捉（NETs） NETs 是嗜中性球受到刺激後，把染色質解聚並釋放到細胞外形成的網狀構造，屬於先天免疫的機制。 主要活性成分：白血球（嗜中性球）自身的 DNA 與組蛋白。DNA 構成網狀骨架；組蛋白本身也具抗菌作用。 附著成分：網上還附著 MPO、彈性蛋白酶、防禦素等顆粒蛋白，用來捕捉、固定並殺滅病原菌。 與呼吸爆發的關係：NADPH oxidase 產生的 ROS 可促進 NET 形成，但兩者是不同的機制。 項目呼吸爆發NETs 場所吞噬體內（細胞內）細胞外 核心成分O₂⁻、H₂O₂、HOCl自身 DNA、組蛋白 作用氧化殺菌網狀捕捉並殺滅病原菌 五、DCFH-DA 搭配流式細胞儀 DCFH-DA（dichlorofluorescein diacetate）是不帶螢光、可穿過細胞膜的探針，作用步驟如下： 進入細胞後，胞內酯酶將它去乙醯化，生成 DCFH。DCFH 不易離開細胞，因此留在細胞內。 DCFH 被細胞內的 H₂O₂ 等活性氧氧化，生成帶綠色螢光的 DCF。 以流式細胞儀測量每個細胞的螢光強度，用來評估細胞內 H₂O₂ 的生成量，也就是呼吸爆發的活性。 這項檢測測量的是 hydrogen peroxide，不是用來測 MPO、嗜天青顆粒或醣類。 常考陷阱 「NADPH oxidase 屬非氧依賴性」：錯誤。它以 O₂ 為受質產生活化氧，是典型的氧依賴性殺菌。非氧依賴性殺菌指的是溶菌酶、乳鐵蛋白、防禦素等。 「NADPH oxidase 屬細胞外毒殺」或「與活化氧無關」：錯誤。它在吞噬體內產生 O₂⁻、H₂O₂，屬細胞內殺菌。 「須經次級顆粒與吞噬體融合」：正確。細胞色素 b558 位於次級顆粒膜上，須經融合才能到達吞噬體膜。 「H₂O₂ 可提升吞噬作用」：錯誤。H₂O₂ 是吞噬之後的殺菌產物，不是調理素。 「抗體可促進趨化」「活化補體可提升吞噬」「細胞骨架很重要」：三者都是正確敘述，不要誤選為錯誤選項。 「Peroxidase 參與形成 ROS」：題目判定不參與。生成 ROS 的是 O₂ + NADPH + NADPH oxidase；peroxidase 是利用 H₂O₂ 的下游酵素。 MPO 的產物：答案是 hypochlorite。superoxide 是 NADPH oxidase 的產物；perforin 是細胞毒性 T 細胞與 NK 細胞的穿孔蛋白，與 MPO 無關。 產生 superoxide 的分子：答案是 NADPH oxidase。selectin 負責滾動，integrin 負責牢固黏附；non-specific esterase 是鑑別單核球的細胞化學染色標記，三者都不是氧化酵素。 NETs 的成分：答案是白血球自身的 DNA 與組蛋白。不是病原菌的 DNA 或內毒素，不是 RNA，也不是含病原菌的內噬體（那是細胞內的吞噬構造）。 DCFH-DA 測什麼：答案是 hydrogen peroxide。它不測 MPO 酵素、嗜天青顆粒或醣類（醣原要用 PAS 染色）。 記憶口訣 「次顆融合送氧化酶，NADPH 給氧變超氧；SOD 轉雙氧，MPO 加氯成次氯；自家 DNA 綁組蛋白，撒網外面抓細菌；DCFH 遇雙氧發綠光。」 補充一句：「O₂、NADPH、oxidase 造 ROS，peroxidase 只是用 ROS。」