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學習重點 抗球蛋白試驗分為兩個階段：第一階段為「致敏／吸附」（抗體結合到紅血球抗原），第二階段為「凝集」（加入 AHG 試劑使已致敏的紅血球互相連結）。增強介質依作用階段不同而有不同機轉。 白蛋白主要作用於凝集階段，機轉為增加介電常數、使紅血球距離縮短而容易凝集。LISS 主要作用於吸附階段，機轉為降低 zeta potential、加速抗體吸附。 PEG 藉排除水分子，提高抗體的有效濃度，促進 IgG 吸附。它不是靠縮短紅血球距離來幫助凝集，也不增強 IgM（如 ABH、Lewis）。 可加強 IgG 吸附的有 LISS、PEG、酵素。一般生理食鹽水（saline）只是標準反應介質，沒有增強作用。 PEG 的偽陽性有兩種來源：37℃ 孵育後直接離心判讀，以及 IgG 濃度過高造成蛋白質沉澱。 核心觀念 一、抗球蛋白試驗的基本原理 抗球蛋白試驗（Coombs test）用來偵測紅血球表面是否已結合 IgG 或補體。步驟如下： 紅血球先與待測血清在 37℃ 下反應，使抗體吸附於紅血球抗原，這是致敏／吸附階段。 洗滌，除去游離的球蛋白。 加入抗人球蛋白試劑（AHG reagent），AHG 與紅血球表面的 IgG 或補體結合，把紅血球互相「橋接」，形成肉眼可見的凝集。 試管法中，血清與紅血球的比例以約 40：1 較為理想。這個比例能提供足量抗體與抗原反應，又不致因細胞過多而降低敏感度。 紅血球表面帶負電（主要來自 sialic acid），周圍會吸引陽離子形成離子雲，造成 zeta potential，使紅血球彼此排斥、保持距離。多數增強介質就是針對這個排斥力，或針對抗體與抗原的接觸機會來設計。 二、白蛋白（Albumin） 常用牛血清白蛋白。它的作用是增加介質的介電常數，使紅血球之間的靜電排斥減弱、距離縮短，已致敏的紅血球因此更容易發生凝集。 白蛋白主要作用在第二階段（凝集階段），對促進抗體吸附的效果有限。因此它的定位是「幫助凝集」，與 LISS、PEG 的「幫助吸附」不同。 三、LISS（低離子強度溶液） LISS 降低反應系統的離子強度，使紅血球與抗體周圍的離子雲變薄，紅血球的 zeta potential 降低。抗體與抗原因此更容易互相接近、結合，抗體吸附速度加快。 作用階段：第一階段（吸附／致敏）。 效果：縮短孵育時間（通常可由 30～60 分鐘縮短為約 10～15 分鐘），並提高偵測敏感度。 LISS 不會水解 sialic acid（那是酵素的作用），也不會直接連結已致敏的紅血球（那是 AHG 的作用）。 四、PEG（Polyethylene glycol，聚乙二醇） PEG 是水溶性高分子，作用機轉是排除反應系統中的水分子（立體排除效應），使抗體的有效濃度提高，促進 IgG 抗體吸附到紅血球上。它對 IgG 抗體的偵測相當有效。 不是凝集增強劑：PEG 作用在吸附階段，不能用「縮短紅血球間距離、幫助凝集」來描述。 不增強 IgM：對 ABH、Lewis 等多屬 IgM 的抗體沒有增強效果，因此主要用於偵測具臨床意義的 IgG 抗體。 37℃ 孵育後不可離心判讀：PEG 存在時離心，會使紅血球發生非特異性聚集，常造成偽陽性。正確流程是孵育後直接洗滌，再加 AHG（建議用 anti-IgG）。 高 IgG 檢體：血清 IgG 濃度過高時，蛋白質可能在 PEG 中沉澱，干擾判讀而造成偽陽性。 五、酵素與生理食鹽水 蛋白酶（如 papain、ficin、bromelin、trypsin）可切除紅血球表面含 sialic acid 的醣蛋白，使負電荷減少、zeta potential 下降，並去除阻礙抗體接近抗原的立體障礙，所以能加強 IgG 抗體反應。例如 Rh、Kidd 系統抗體經酵素處理後反應會增強。要注意，酵素也會破壞部分抗原，例如 M、N、S、Duffy（Fya、Fyb），使相對應抗體的反應減弱或消失。 生理食鹽水提供等張的標準反應環境，離子強度正常，不會降低 zeta potential，也不能提高抗體有效濃度，所以不能用來加強 IgG 抗體吸附。 六、增強介質比較表 介質作用機轉主要作用階段重點／限制 白蛋白增加介電常數，使紅血球距離縮短凝集階段促進吸附的效果有限 LISS降低離子強度與 zeta potential，加速抗體吸附吸附階段縮短孵育時間、提高敏感度 PEG排除水分子，提高抗體有效濃度吸附階段只增強 IgG、不增強 IgM；37℃ 後不可離心判讀；高 IgG 檢體可能沉澱 酵素切除 sialic acid，降低負電與立體障礙吸附階段增強 Rh、Kidd 等抗體；破壞 M、N、S、Duffy 抗原 生理食鹽水只提供等張環境—無增強作用 常考陷阱 「PEG 可縮短紅血球間的距離，幫助凝集反應」：錯。「縮短距離、幫助凝集」是白蛋白的描述。PEG 是排除水分子以促進 IgG 吸附，而且在 PEG 中離心反而會造成非特異性聚集。 「白蛋白增加介電常數，使血球距離縮短而容易凝集」：正確。不要因為白蛋白促進吸附的效果有限，就把這句判為錯誤。 「LISS 促進抗體吸附、減少孵育時間、提高敏感度」：正確。LISS 的原理是降低 zeta potential，縮短抗體吸附所需時間。 「LISS 讓已附有抗體或補體的血球互相連結」：錯。這是 AHG 試劑的作用。 「LISS 讓血球表面具親水性而容易靠近」：錯。LISS 的機轉是降低離子強度，與親水性無關。 「LISS 水解紅血球表面 sialic acid」：錯。這是蛋白酶的作用。 「Saline 可加強 IgG 吸附」：錯。LISS、PEG、酵素都可以，只有生理食鹽水不行。 「PEG 會加強 ABH 或 Lewis 等 IgM 抗體偵測」：錯。PEG 只有效增強 IgG。 「PEG 在 37℃ 孵育後離心觀察常有偽陽性」、「IgG 濃度過高時蛋白質可能沉澱造成偽陽性」：兩句都正確。不要誤判為錯誤選項。 記憶口訣 「白蛋白管凝集（介電常數升），LISS、PEG 管吸附；LISS 降 zeta，PEG 擠掉水。」 「PEG 只愛 IgG，ABH、Lewis 不理你；37℃ 別離心，高 IgG 會沉澱；鹽水一般般，不能來增強。」