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學習重點 AHG 試驗（Coombs test）分為直接（DAT）與間接（IAT）兩種：DAT 偵測已附著於病患紅血球表面的抗體或補體；IAT 偵測病患血清（血漿）中游離的不完全抗體。 AHG 的作用原理是「搭橋」：AHG 試劑與紅血球表面的 IgG 或補體 C3 結合，把已致敏的紅血球連結起來，使原本看不出來的致敏反應變成肉眼可見的凝集。 清洗紅血球是必要步驟：目的是去除紅血球周圍殘留的血清或血漿（游離球蛋白），以免中和 AHG 試劑而造成偽陰性。 多特異性 AHG 主要含 anti-IgG 與 anti-C3d：抗補體成分以 anti-C3（尤其 anti-C3d）最重要，不含 anti-IgM 作為主要成分。 Coombs 對照細胞（check cells）以 O(+) 紅血球經 anti-D 致敏製備：用來驗證 AHG 試劑仍具活性、陰性結果真實可信。 核心觀念 一、AHG 試驗的目的與作用原理 IgG 這類不完全抗體分子較小，雖能與紅血球抗原結合（致敏），但通常無法跨越紅血球間的距離而直接造成凝集；補體 C3 沉積於紅血球上時也一樣看不出凝集。AHG 試劑是抗人類球蛋白抗體（針對人類 IgG 及補體成分），加入後會與紅血球表面的抗體或補體結合，在相鄰的致敏紅血球之間搭橋，產生可見凝集。 因此 AHG 試驗最主要的目的，是偵測不會直接凝集紅血球的 IgG 不完全抗體或補體，而不是偵測 IgM 完全抗體；IgM 在鹽水中即可直接凝集紅血球，不需 AHG。 AHG 的作用不是降低紅血球的 zeta potential，不是移除紅血球膜上的唾液酸（sialic acid），也不是讓紅血球變得更疏水；這些是增強劑或酵素處理的作用機轉，與 AHG 無關。 AHG 試驗能回答「紅血球上有沒有吸附抗體或補體」「血清中有沒有游離的不完全抗體」，但不能判斷紅血球膜是否有功能缺損，也不能判斷補體是否具有活性。 二、DAT 與 IAT 的比較 比較項目 直接抗球蛋白試驗（DAT，direct Coombs' test） 間接抗球蛋白試驗（IAT，indirect Coombs' test） 偵測對象 病患紅血球表面已附著（體內致敏）的抗體或補體 病患血清／血漿中游離的不完全抗體（以 IgG 為主） 使用的紅血球 病患自身紅血球 已知抗原的試劑紅血球（篩檢細胞、panel cells）或捐血者紅血球 是否需孵育 不需，直接清洗後加 AHG 需先將血清與紅血球於 37°C 孵育（體外致敏） 操作步驟 病患紅血球 → 生理食鹽水清洗 → 加 AHG → 離心判讀 血清＋試劑紅血球 37°C 孵育 → 清洗 → 加 AHG → 離心判讀 典型應用 自體免疫溶血性貧血（AIHA）、藥物引起之免疫溶血、溶血性輸血反應、新生兒溶血病（檢查新生兒紅血球） 不規則抗體篩檢與鑑定、交叉試驗、弱 D（Du）檢測、紅血球抗原分型 清洗的意義：血清或血漿中含有大量游離的人類球蛋白，若未洗淨，會先與 AHG 結合而將其中和，導致應為陽性的檢體呈現偽陰性。所以清洗紅血球就是為了去除殘留在紅血球周圍的血清或血漿。 DAT 與其他溶血檢查的區別：自體免疫溶血性貧血是紅血球在體內被自體抗體或補體致敏，最適用的檢驗是 Coombs' test（DAT）。滲透脆性試驗（osmotic fragility test）用於遺傳性球形紅血球症；蔗糖水試驗（sugar water test）與酸溶血試驗（Ham's test）用於陣發性夜間血紅素尿症（PNH）。 哪些情形用 DAT：凡要探討「紅血球在體內是否已被抗體或補體覆蓋」者用 DAT，例如探討藥物引起之免疫溶血。傳統三階段抗體鑑定、弱 D（Du）檢測，都是讓試劑抗體或血清抗體在體外與紅血球反應後再加 AHG，屬於 IAT 原理；ABO 反向定型則是以 A、B 細胞測血清中的 IgM 抗體，直接看凝集，不需 AHG。 三、多特異性與單一特異性 AHG 試劑 多特異性（polyspecific）AHG：主要含 anti-IgG 與 anti-C3d（部分產品另含 anti-C3b）。其抗補體成分最重要的是 anti-C3，而在 anti-C3 中又以 anti-C3d 最常見。原因是補體活化後，C3 片段大量沉積在紅血球上，最後降解成 C3d 長期留在膜上，最具偵測價值。 單一特異性（monospecific）AHG：只含單一成分，例如只含 anti-IgG，或只含 anti-C3d／anti-C3b。DAT 陽性時可用來區分紅血球上致敏的是 IgG、補體，或兩者皆有。 多特異性 AHG 的抗補體成分不是 anti-C1、anti-C2、anti-C4、anti-C5b、anti-C6，也不以 anti-IgM 為主要成分。 四、不規則抗體檢測的相關觀念 抗體篩檢細胞與抗體鑑定細胞組（panel cells）使用 O 型紅血球，避免病患血清中的 anti-A、anti-B 干擾。 只在室溫發生的凝集多為 IgM 冷抗體，通常不具臨床意義；在 37°C 或 AHG 階段反應的抗體（多為 IgG）較具臨床意義。 AHG 試劑用於偵測 IgG（不完全抗體）及補體，不是用於偵測 IgM 抗體。 在臺灣，anti-Mi（Miltenberger 系統相關抗體）是常檢出的不規則抗體之一，與臺灣人 Mi(a+) 頻率較高有關。 五、Coombs 對照細胞的製備與品管 製備方式：取 O 型 Rh 陽性 [O(+)] 紅血球，以 anti-D（IgG）致敏，再徹底洗去游離的 anti-D。 選 O 型：沒有 A、B 抗原，不會被 anti-A、anti-B 影響。 選 D 陽性：才能被 anti-D 致敏。 用 anti-D：屬 IgG 抗體，致敏後不會自行凝集，必須加入 AHG 才凝集，正好可驗證 AHG 的 anti-IgG 活性。 AB(+) 紅血球帶有 A、B 抗原，若以 anti-A、anti-B（多為 IgM）處理，會直接凝集，無法作為 AHG 對照；anti-H 也不是製備標準對照細胞的抗體。 使用方式：每一支 AHG 試驗結果判讀為陰性的試管，都要再加入 Coombs 對照細胞並離心，必須出現凝集才代表陰性結果有效。若不凝集，表示 AHG 已被殘留的游離球蛋白中和（清洗不完全）、AHG 忘了加或失效，原試驗須重做。 常考陷阱 DAT／IAT 對象顛倒：「紅血球上附著的抗體」用 direct Coombs' test；「血漿中游離的抗體」用 indirect Coombs' test。兩者不會都用同一種。 IAT 偵測「紅血球表面」或「完全抗體」：錯。IAT 偵測的是血清中的不完全抗體。 「AHG 主要偵測 IgM 完全抗體」「AHG 用於偵測 IgM 抗體」：錯。IgM 可直接凝集，AHG 偵測的是 IgG 與補體。 「加入 AHG 是為了避免偽陽性」：錯。加入 AHG 是為了讓致敏紅血球產生可見凝集；清洗才是為了去除殘留血清，以免造成偽陰性。 「AHG 試驗無法得知紅血球表面是否已吸附抗體」：錯。這正是 DAT 的用途。 「AHG 試驗可測紅血球功能缺損／補體是否有活性」：錯。AHG 只能偵測紅血球上是否結合了球蛋白或補體。 「AHG 是抗老鼠球蛋白抗體」：錯。AHG 是抗人類球蛋白抗體。 AHG 作用機轉選「降低 zeta potential」「移除唾液酸」「增加疏水性」：都是錯的。正確答案是「與紅血球表面抗體或補體結合」。 多特異性 AHG 含 anti-IgG＋anti-IgM：錯。正確是 anti-IgG＋anti-C3d；抗補體成分最重要的是 anti-C3，最常見的是 anti-C3d。 AIHA 選滲透脆性、蔗糖水、Ham's test：這些分別用於球形紅血球症與 PNH；AIHA 用 Coombs' test。 需要 DAT 的情形選三階段抗體鑑定、Du 檢測、ABO 反向定型：前兩者屬 IAT 原理，反向定型不用 AHG；藥物引起之免疫溶血才需 DAT。 Coombs 對照細胞選 AB(+)、anti-H、anti-A／anti-B：都錯。正確是 O(+) 經 anti-D 致敏。 記憶口訣 直接看紅血球，間接看血清；DAT 查「已黏上」，IAT 查「還游離」。 AHG 搭橋抓 IgG，IgM 自己會凝集。 多特異性：G 加 C3d；補體最重要，C3 一枝獨秀。 洗不乾淨被中和，陰性變假的；Coombs 對照 O 正 D，陰性管裡要凝集。